，同型半胱氨酸甲基化为蛋氨酸的过程受阻，导致同 型半管氨酸浓度升高，蛋氨酸浓度降低。1999年便有研宄证明先天性心脏缺损与同型半胱 氨酸的关系，近期的研宄更进一步确认同型半胱氨酸和蛋氨酸为先天性心脏缺损的生物标 记。
[0022] 测定Hey的方法很多，使用最多的有高效液相色谱法（HPLC)、酶免疫分析法 (EIA)、离子色谱法、荧光偏振免疫分析法。临床上使用较多的为高效液相色谱和气象色谱 质谱联用法。但这些方法均存在实验耗时长、成本较高、重复性差、操作复杂、不易普及和推 广等缺点。已有专利CN101096705A、CN101864479A和CN101037708A等均指明了部分检 测MTHFR基因多态性对预测同型半胱氨酸水平和/或同型半胱氨酸相关联疾病的发生及预 后的用途，【具体实施方式】的举例中均采用血液为样本，进行核酸提取后通过聚合酶链式反 应（PCR)对MTHFR基因进行扩增，进而通过限制性内切酶对扩增产物进行酶切，通过琼脂糖 凝胶电泳对通过酶切的核酸扩增产物片段长度大小进行判断，进而判断MTHFR基因的多态 性。
[0023] 由于叶酸的缺乏和同型半胱氨酸对很多相关疾病的影响，使得MTHFR的基因多态 性检测显得尤为重要，而临床目前常用的检测方法存在一些缺陷且缺乏预见性，为了更早 地预见同型半胱氨酸水平并预防和干预与同型半胱氨酸相关联的疾病的发生和进展，就需 要对同型半胱氨酸的水平进行尽可能早的进行预测。
【发明内容】
[0024] 本发明的目的是克服了上述现有技术的缺点，提供了一种能够快速准确无创的亚 甲基四氢叶酸还原酶基因多态性检测的试剂盒及检测方法。
[0025] 为了实现上述目的，本发明具有如下构成：
[0026] 该亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性检测试剂盒，其主要特点是，所述的试剂盒 包括：核酸抽提试剂和核酸检测试剂，所述的核酸检测试剂包括含荧光探针的PCR反应液、 阴性对照及阳性对照，所述的核酸抽提试剂为DNA提取液；其中所述的PCR反应液包括DNA 聚合酶、UNG酶、引物、探针及Mg2+，所述的探针为分子信标探针。
[0027] 优选地，所述的DNA提取液，包括Che lex-100及EDTA。
[0028] 更优选地，所述的阴性对照为纯化水。
[0029] 优选地，所述的阳性对照包括3组，阳性对照1为含野生型纯合子MTHFR序列的质 粒；阳性对照2为含突变体纯合子MTHFR序列的质粒；以及阳性对照3为等比例混合的阳性 对照1和阳性对照2。
[0030] 更优选地，所述的阳性对照1的野生型纯合子MTHFR序列为SEQIDNO: 1所示的 核苷酸序列；所述的阳性对照2的突变体纯合子MTHFR序列为SEQIDNO: 2所示的核苷酸 序列。
[0031] 进一步优选地，所述的检测试剂盒的检测样本为口腔脱落细胞。
[0032] 更进一步优选地，所述的PCR扩增所使用的引物序列分别为SEQIDN0:3所示的 上游引物核苷酸序列和SEQIDN0:4所示的下游引物核苷酸序列。
[0033] 最优选地，所述的探针为：
[0034] 突变体探针的序列为SEQIDN0:5所示的核苷酸序列，检测通道为FAM，其中5'修 饰基团为FAM，3'修饰基团为Dcabl;
[0035] 野生型探针的序列为SEQIDN0:6所示的核苷酸序列，检测通道为J0E，其中5'修 饰基团为J0E，3'修饰基团为Dcabl。
[0036] 根据所述的亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性检测试剂盒的检测方法，其主要特 点是，所述的检测方法包括：
[0037] (1)加样准备：将处理好的样本5yL加入PCR反应液45yL中待扩增；
[0038] (2)PCR扩增：将混合均匀的样本进行PCR扩增，并检测荧光信号；
[0039] (3)分析结果：在同时满足四个对照组标准的情况下，分析样本；
[0040]其中所述的荧光检测步骤中将Base 1 ine设为3~15，荧光阈值设定原则为阈值线 刚好超过阴性对照品扩增曲线的最高点，且Ct值显示为Undet。
[0041] 优选地，所述的样本处理步骤包括：
[0042] (1. 1)将含1ml样本的离心管充分振荡，12000rpm离心5分钟，弃上清。
[0043] (1. 2)沉淀中加入lmL生理盐水，旋涡振荡器上振荡分散沉淀，12000rpm离心5分 钟，弃上清。
[0044] (1. 3)往沉淀中加入已振荡混匀的DNA提取液50yL，旋涡振荡器上振荡打散沉 淀，99 °C干浴或者水浴10分钟。
[0045] (1. 4) 12000rpm离心5分钟，在不触动管子底部的沉淀物的情况下吸取上清液用 于PCR反应。
[0046] 更优选地，所述的PCR扩增步骤包括：
[0047] (2. 1)样品设置：在仪器软件的相应样本设置窗口内填写各样本的名称、类型及 工作标准品参数。
[0048] (2. 2)焚光通道选择：每个样品选择FAM和J0E2个通道。参比焚光设置为none。
[0049] (2. 3)反应条件设定：反应体积设定为50yL，反应条件如下：UNG酶反应条件： 37°C加热5分钟，预变性条件为95°C加热5分钟，变性条件为95°C，15秒，以及退火、延伸及 检测荧光条件为60°C，1分钟，共40个循环。
[0050] 进一步优选地，所述的四个对照组标准如下：
[0051] 阴性对照：FAM通道和J0E通道无明显扩增曲线，且Ct显示为Undet。
[0052] 阳性对照1J0E通道有扩增曲线，且Ct〈36 ;FAM通道无明显S型扩增曲线，且Ct 显示为Undet。
[0053] 阳性对照2 :FAM通道有扩增曲线，且Ct〈36JOE通道无明显S型扩增曲线，且Ct 显示为Undet。
[0054] 阳性对照3 :FAM、JOE通道有典型的扩增曲线，且Ct〈36;
[0055] 上述四个条件必须同时满足，否则，本次试验无效。
[0056] 更进一步优选地，用于检测同型半胱氨酸水平和/或同型半胱氨酸相关联疾病的 发生及预后检测。
[0057] 进一步优选地，所述的MTHFR的基因多态性位点为C67H多态性位点。
[0058] 更进一步优选地，所述的MTHFR的基因多态性位点有以下特点：
[0059] (1)当MTHFR基因多态性检测结果为677TT突变体纯合子时，预测其同型半胱氨酸 水平较高且同型半胱氨酸水平升高的可能性较大；
[0060] (2)当MTHFR基因多态性检测结果为677CT杂合子型和/或677CC野生型纯合子 时，预测其同型半胱氨酸水平较低且同型半胱氨酸水平升高的可能性较小；
[0061] (3)当MTHFR基因多态性检测结果为677TT突变体纯合子时，预测其同型半胱氨酸 水平相关联疾病的发病率较高；
[0062] (4)当MTHFR基因多态性检测结果为677CT杂合子型和/或677CC野生型纯合子 时，预测其同型半胱氨酸水平相关联疾病的发病率较低。
[0063] 采用了该发明中的检测试剂盒及检测方法，其优点在于：
[0064] 1.操作简单、快速，本发明核酸抽提部分采用煮沸法，操作简单，仅需要一般实验 室所使用的离心机和水浴锅或金属浴即可，在35分钟内便可完成样本核酸的抽提处理全 过程，且扩增部分可一次进行最多96个样本的测试（含3个阳性对照和1个阴性对照样 本）。
[0065] 2.降低耗材的使用以便降低检测成本，采用本发明的方法在操作的全过程中需要 的耗材只有核酸抽提所使用的1. 5ml离心管、扩增使用的八连管或96孔板以及移液器吸 头。
[0066] 3.检测结果准确，降低假阳性结果的出现，在扩增步骤加入阴性对照和阳性对照， 以此可以有效提高对假阳性和假阴性出现的判断。
[0067] 4.对实验污染的有效减少，a.本专利采用荧光探针PCR方法，既将核酸的PCR扩 增所用试剂组分一次性加入反应管中并采用荧光PCR仪进行扩增反应，为全封闭反应检测 环境；b.加入尿嘧啶DNA糖基化酶（UNG)并以dUTP替代dNTP等PCR污染控制措施可有效 防止PCR的污染；c.采用分子信标探针以提高检测特异性；用于检测MTHFR基因多态性的 等位基因特异性核酸引物和用于检测MTHFR基因多态性的寡核苷酸探针，探针为分子信标 探针，分子信标探针与线性的TaqMan探针相比，因其发夹结构的打开需要一定的力，因而 测定的特异性要好于线性探针。因此，分子信标探针更适合用于鉴定点突变，提高检测性 能，涉及到的引物和探针均可特异地与MTHFR的多态性位点进行杂交。
[0068] 5.更高的检测精密度，且PCR方法可