对目的基因片段进行指数增长式的扩增，因 此本专利具有更高的检测精密度。在测试精密度时，将同一样本进行十次重复抽提并同时 进行扩增，杂合子、野生型纯合子、突变体纯合子精密度扩增结果分别如图1、2、3所示。精 密度以CV值小于5%为达标水平。图中Amplificationplot为扩增图谱，ARn为在给定 的一组PCR条件下所生成信号的量值；Cycle为循环。具体见表1 :
[0069]表1:检测精密度表
[0071]
【附图说明】
[0072] 图1为本发明的杂合子精密扩增结果图；
[0073] 图2为本发明的野生型纯合子精密扩增结果图；
[0074] 图3为本发明的突变体纯合子精密扩增结果图；
[0075] 图4为本发明的杂合子样本检测结果图；
[0076] 图5为本发明的野生型纯合子样本检测结果图；
[0077] 图6为突变体纯合子样本检测结果图。
【具体实施方式】
[0078] 为了能够更清楚地描述本发明的技术内容，下面结合具体实施例来进行进一步的 描述。
[0079] 本发明所述的亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性检测的检测试剂盒如下：
[0080] 1.试剂盒包含试剂如下所示：
[0082] 2.为了解决PCR实验经常出现的污染或错误检测结果问题，本发明采取以下措 施：
[0083] (1)加入尿嘧啶DNA糖基化酶（UNG)并以dUTP替代dNTP等PCR污染控制措施可 有效防止PCR的污染；
[0084] (2)采用分子信标探针以提高检测特异性；
[0085] (3)在检测过程中加入阴性对照和阳性对照，可有效减少假阳性和假阴性对实验 结果判断的影响。
[0086] (4)本发明所使用的检测样本采用口腔脱落细胞而非血液，达到无创检测的水平。
[0087] 本发明所述的用途、方法和试剂盒中，MTHFR的基因多态性位点为C67H多态性位 点。
[0088] 在发明中，与同型半胱氨酸相关的疾病包括心血管疾病、非综合征性唇腭裂、男性 不育、复发性自然流产、早产、高血压、神经管缺损、心脏缺陷。
[0089] (1)当MTHFR基因多态性检测结果为677TT突变体纯合子时，预测其同型半胱氨酸 水平较高且同型半胱氨酸水平升高的可能性较大；
[0090] (2)当MTHFR基因多态性检测结果为677CT杂合子型和/或677CC野生型纯合子 时，预测其同型半胱氨酸水平较低且同型半胱氨酸水平升高的可能性较小；
[0091] (3)当MTHFR基因多态性检测结果为677TT突变体纯合子时，预测其同型半胱氨酸 水平相关联疾病的发病率较高；
[0092] (4)当MTHFR基因多态性检测结果为677CT杂合子型和/或677CC野生型纯合子 时，预测其同型半胱氨酸水平相关联疾病的发病率较低。
[0093] 本发明所述的亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性检测的检测方法如下：
[0094] 1试剂准备：
[0095] 1. 1从试剂盒中取出MTHFR PCR反应液，室温解冻，完全融化后，轻轻振荡混匀，并 作短暂离心备用。
[0096]1. 2根据待检样本数（n)，计算需要配制的反应数。
[0097] (1)每反应总体积（50yL) =MTHFRPCR反应液（45yL) + 模板（5yL)。
[0098] (2) n个样本PCR反应液的配制
[0099]MTHFRPCR反应液（45yL)X(n+4)其中（n+4)的'4'指3个阳性对照和1个阴性 对照。
[0100] 1. 3每个反应管分装45yLPCR反应液。
[0101] 2?样本处理（口腔脱落细胞DNA提取）：
[0102] 2. 1将含1ml样本的离心管充分振荡，12000rpm离心5分钟，弃上清。
[0103] 2. 2沉淀中加入lmL生理盐水（用户自备），旋涡振荡器上振荡分散沉淀， 12000rpm离心5分钟，弃上清。
[0104] 2. 3往沉淀中加入已振荡混匀的DNA提取液50yL，旋涡振荡器上振荡打散沉淀， 99 °C干浴或者水浴10分钟。
[0105] 2.4 12000rpm离心5分钟，上清液用于PCR反应。（吸取时不要触动管子底部的 沉淀物）。
[0106] 提取好的DNA应及时用于检测，否则应-20°C保存，再次使用时，将提取好的DNA完 全融化后12000rpm离心5分钟，取上清液用于PCR反应。
[0107] 3?加样：
[0108] 在准备好试剂的PCR反应管中分别加入阴性对照、待测样本DNA、阳性对照各 5yL，盖紧管盖后，瞬时低速离心。
[0109] 4.PCR扩增：
[0110] 4. 1样品设置：在仪器软件的相应样本设置窗口内填写各样本的名称、类型及工 作标准品参数。
[0111] 4. 2荧光通道选择：每个样品选择FAM和J0E2个通道。参比荧光（Passive Reference)设置为none。
[0112] 4. 3反应条件设定
[0114] 反应体积设定为50yL。
[0115] 4. 4保存文件，运行程序。
[0116] 5?结果分析
[0117]ABI7500 荧光PCR仪：将Baseline设为 3-15 (根据实际情况，BaselineCycler 可在一定范围内变化），荧光阈值（Threshold)设定原则以阈值线刚好超过阴性对照品扩 增曲线（无规则的噪音线）的最高点，且Ct值显示为Undet。使用仪器配套软件自动分析 结果。
[0118] 6.质控标准
[0119] 6. 1阴性对照：FAM通道和J0E通道无明显扩增曲线，且Ct显示为Undet。
[0120] 6. 2阳性对照1 :J0E通道有扩增曲线，且Ct〈36 ;FAM通道无明显S型扩增曲线，且 Ct显不为Undet。
[0121] 6. 3阳性对照2 :FAM通道有扩增曲线，且Ct〈36JOE通道无明显S型扩增曲线，且 Ct显不为Undet。
[0122] 6. 4阳性对照3 :FAM、JOE通道有典型的扩增曲线，且Ct〈36。
[0123] 6. 5上述四个条件必须同时满足，否则，本次试验无效。
[0124] 7.检验结果解释
[0125] 在实验有效的前提下，结果分析如下：
[0127] 8.PCR扩增所使用的引物序列：
[0129] 9.探针序列
[0130]
[0131] 10.阳性对照序列
[0132] 纯合子野生型阳性对照序列：
[0133] GAAGGTGCAAGATCAGAGCCCCCAAAGCAGAGGACTCTCTCTGCCCAGTCCCTGTGGTCTCTTCATC CCTCGCCTTGAACAGGTGGAGGCCAGCCTCTCCTGACTGTCATCCCTATTGGCAGGTTACCCCAAAGGCCACCCC GAAGCAGGGAGCTTTGAGGCTGACCTGAAGCACTTGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGAGCCGATTTCATCATCACG CAGCTTTTCTTTGAGGCTGACACATTCTTCCGCTTTGTGAAGGCATGCACCGACATGGGCATCACTTGCCCCATC GTCCCCGGGATCTTTCCCATCCAGGTG
[0134] 纯合子突变体阳性对照序列：
[0135] GAAGGTGCAAGATCAGAGCCCCCAAAGCAGAGGACTCTCTCTGCCCAGTCCCTGTGGTCTCTTCATC CCTCGCCTTGAACAGGTGGAGGCCAGCCTCTCCTGACTGTCATCCCTATTGGCAGGTTACCCCAAAGGCCACCCC GAAGCAGGGAGCTTTGAGGCTGACCTGAAGCACTTGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGAGTCGATTTCATCATCACG CAGCTTTTCTTTGAGGCTGACACATTCTTCCGCTTTGTGAAGGCATGCACCGACATGGGCATCACTTGCCCCATC GTCCCCGGGATCTTTCCCATCCAGGTG
[0136] 11. PCR反应液配方：
[0138]
[0139] 12.核酸抽提试剂：
[0141] 13.样本的检测：
[0142] 本发明中对样本的检测结果如图4 (杂合子）、图5 (野生型纯合子）、图6 (突变体 纯合子）所示，结果分析依据【具体实施方式】7。图中圆圈圈