，无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂，得粗产物，柱层析后得衍生物DCA-UP。
[0013] 性状：白色粉末；产率：92. 71% ; IR数据：：见图3 HRMS :理论值：635. 3741 m/z 实际值：635. 3758 m/z 1HNMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.96 (d, / = 1.9 Hz, 1H), 5.24 (s, 1H), 4.63 (d, /= 6. 7 Hz, 1H), 3.84 (s, 4H), 3.08 (s, 4H), 2.40 (s, 1H), 2.19 (d, J= 13.8 Hz, 1H), 1.94 (s, 2H), 1.74 (t, J= 13.7 Hz, 6H), 1.61 - 1.41 (m, 6H), 1.41 -1.18 (m, 4H), 1.06 (d, J= 35.4 Hz, 7H), 0.97 - 0.78 (m, 16H), 0.77 (d, J =24.0 Hz, 5H), 0.02 (d, / = 2. I Hz, 1H). 实施例3:DCA-UH的合成 室温下，0.5 g DCA-UA溶于20 mL二氯甲烷，在磁力搅拌条件下，向前述溶液中缓慢滴 加0.6mL草酰氯，滴加完成后继续搅拌8-10h。反应完全后，减压蒸除气体和溶剂。磁力 搅拌下，将前述产物溶于20 mL二氯甲烷，并缓慢的向溶有0.5 g己二胺和100 μ L三乙胺 的20 mL二氯甲烷溶液中滴加。滴加完成后，继续搅拌12h。反应完全后，向反应瓶中补充 加入20 mL二氯甲烷，用50 mL IN HCl溶液萃取反应体系2-4次，直至pH为3-4,分液收 集有机层，无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂，得粗产物，柱层析后得衍生物DCA-UH。
[0014] 性状：白色粉末；产率：9L 66% ; IR数据：见图4 HRMS :理论值：665. 4210 m/z 实际值：665. 4210 m/z 1HNMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.32 (s, 3H), 6.07 (s, 1H), 5.97 (d, / = 1.9 Hz, 1H), 5.34 (s, 1H), 4.63 (d, / = 5.6 Hz, 2H), 3.34 (s, 1H), 3.03 (s, 4H), 2.73 (s, 6H), 2.06 - 1.66 (m, 6H), 1.64 - 1.21 (m, 14H), 1.20 - 0.69 (m, 22H), 0. 02 (d, /= I. 9 Hz, 1H). 实施例4 MTT法检测药物对肿瘤细胞的增殖抑制作用 (1)取处于对数生长期状态良好的细胞一瓶，胰蛋白酶消化，制成5X104个/ml的细 胞悬液。
[0015] (2)细胞悬液移入96孔板，每孔100 μ L，周围一圈用PBS填充，置37°C，5% CO2培养箱中培养24 h。
[0016] (3)移去旧培养基，加入受试衍生物(用培养基将受试衍生物存储液稀释，设定不 同作用浓度)，每孔l〇〇ul，另设空白对照组、UA对照组（UA 60ymol/L或20umol/L)和紫 杉醇对照组（60 umol/L或20umol/L)，每组设6个复孔。药物作用24 h后，吸弃含药培 养基，于每孔中加入无血清、无酚红1640培养基100ul，再加入MTT溶液10ul，继续孵育4 h，终止培养。
[0017] (4)小心吸弃96孔板孔内上清液，每孔加入150ul DMS0,振荡10 min，于490 nm. 波长处在酶标仪上测定各孔光吸收值（0D值），计算细胞的增殖抑制率：抑制率（％) = (1-用药组平均OD值+空白对照组平均OD值）X 100%，应用SPSS16.0软件进行数据处 理并计算癌细胞增殖的半数抑制浓度（IC5(I)。见图5~8。化合物DCA-UP和DCA-UH对MCF-7、 RL95-2、B16F10、4T1等多种肿瘤细胞株均具有明显抑制增殖作用。
[0018] 实施例5化合物溶解性测试 试了所合成的熊果酸二氯乙酰类衍生物在水、二甲基亚砜（DMS0)、N，N-二甲基甲酰胺 (DMF)、二氯甲烷（DCM)、丙酮、乙酸乙酯（EA)、石油醚（PE)、甲醇中的溶解性。具体实验方法 如下： 称取I mg样品溶于0.2 mL溶剂中，观察其溶解情况，将溶解情况分为以下四个等级： A :易溶，样品加入即刻全部溶解； B :可溶，借助超声助溶5min后溶解； C :微溶，超声波助溶5min后仍有部分不溶解； D :不溶，超声波助溶5min后仍不溶解。
[0019] 测试结果见图9。
[0020] 本专利报道的三个化合物在水中的溶解度和在有机溶剂中的溶解度与UA相比， 均有所改善。
[0021] 实施例6肿瘤细胞中乳酸含量检测 (1)选取对数生长期的B16F10细胞均匀地铺在6孔板内，每孔大约50X IO4个。
[0022] (2)将药物加入6孔板，培养24h。
[0023] (3)根据乳酸测试试剂盒配制酶工作液和试剂D显色液。按照下表的操作步骤依 次加入相应的试剂。待测样品直接从药物作用后的培养基中吸取20 μ L。
[0024] 上述溶液混匀后，530nm处测定各管的吸光值。根据计算公式：
计算培养基中乳酸含量。见图10。
[0025] 由图10可知，三个二氯乙酰类熊果酸衍生物DCA-UA、DCA-UP、DCA-UH能使细胞产 生的乳酸量明显降低。说明DCA和UA及其衍生物偶联后的药物可抑制肿瘤细胞糖代谢作 用。
[0026] 实施例7肿瘤细胞中ATP含量检测 1.样品的制备 (1)选取对数生长期的B16F10细胞均匀地铺在6孔板内，每孔大约50X IO4个。
[0027] (2)将药物加入24孔板，培养6h、12h和24h。
[0028] (3)吸出培养液，每孔加入40 μ L裂解液裂解细胞。裂解时需不断吹打使裂解液充 分接触细胞。裂解后4°C 12000g离心10min，取上清，-20°C保存。使用BCA蛋白浓度检测 试剂盒测定样品中的蛋白浓度。
[0029] 2.标准曲线的测定准备和ATP检测工作液的制备 (4 )冰浴ATP标准溶液、ATP检测裂解液和ATP检测试剂稀释液。将ATP标准溶液 (0. 5mM)用ATP检测裂解液稀释成0、0. 1、1、5、10、20六个浓度梯度。
[0030] (5)按照ATP检测试剂：ATP检测试剂稀释液=1:100的比例配制ATP检测工作液， 每个样品中需加入100 μ L。稀释后的ATP检测工作液在冰浴上暂存。
[0031] 3. ATP浓度的测定 (6)加入100 μ L的ATP检测工作液到检测孔中，室温放置3min，使本底的ATP全部消 耗掉。
[0032] (7)在检测孔加入10 μ L样品或标准品，混匀后迅速用多功能酶标仪的 Iuminometer模式测定RLU值。绘制标准曲线并计算样品中ATP的含量。
[0033] 见图 11。
[0034] 由图11可知，相对于空白组，加药组的ATP含量明显降低。说明说明DCA和UA及 其衍生物偶联后对肿瘤细胞糖代谢途径的ATP生成有明显抑制作用。
【主权项】
1. 如式（I)、（II)或（III)所示的熊果酸衍生物2. 如权利要求1所述的熊果酸衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种熊果酸衍生物及其应用，具体说是一种熊果酸及其衍生物二氯乙酰化后形成的一类新的一种兼具抗肿瘤细胞凋亡和代谢双重靶向功能的熊果酸衍生物及其应用。如式(I)、(II)或（III）所示的熊果酸衍生物 及其在制备抗肿瘤药物中的应用。
【IPC分类】A61K31/58, A61K31/56, A61P35/00, C07J63/00
【公开号】CN104987356
【申请号】CN201510318654
【发明人】邵敬伟, 杨祥, 郑清, 陈秀芬, 禹小波, 向利平
【申请人】福州大学
【公开日】2015年10月21日
【申请日】2015年6月11日...