] 实施例5不同共培养方法对转基因西瓜转化率的影响
[0096] 方法I为现有技术中常规的共培养方法，即将农杆菌侵染的外植体置于固体共培 养基上。
[0097] 方法II为在外植体与固体共培养基之间，铺一层滤纸，且无液体共培养基。
[009引方法HI为本申请实施例1记载的共培养方法，即在=层无菌滤纸上，加入液体共 培养基，加入的液体共培养基的量满足刚好浸润滤纸且无多余液体流出并保证28°C共培养 4天后滤纸不干涧。
[0099] 按照本申请实施例1记载的方法制备转基因西瓜，仅在步骤3的共培养阶段分别 采用上述方法I、方法II和方法III。实验结果见图3-5。
[0100] =种方法28°c共培养4天后外植体表面农杆菌数量检测，外植体各20块，浸泡在 2ml无菌水中lOmin，稀释1000倍，取200yL稀释后的液体涂布在含有抗生素（卡那霉素 200mg/L+利福平50mg/L+庆大霉素lOOmg/L)的LB固体培养基上，28°C倒置培养4她后统 计菌落数量。结果如图3所示，经过统计农杆菌菌落数量，传统共培养方法菌落数为550个， 共培养基附加一层滤纸和液体共培养基浸润的=层滤纸作为共培养方法菌落数分别为120 和348个，远低于传统共培养方法，因此均能够控制农杆菌生长。
[0101] 通过对不同处理下外植体上的农杆菌进行悬浮液涂布计数，可W看见，外植体与 琼脂培养基直接接触的常规方法下（方法I)，子叶切块上的农杆菌生长旺盛，活细胞数最 多（平均为27. 5CFU/切块），而在=层湿滤纸的隔离下（方法III)，子叶切块上的农杆菌 活细胞数量降低（平均为17. 4CFU/切块）。进一步对不同共培养方法下外植体的生长情 况调查可见，光照培养4小时后方法III外植体切块的转绿率达到68. 09%，切块平均鲜重达 17mg/个；而方法I外植体块转绿率为48. 57 %，平均鲜重为14mg/个，方法II(在外植体与 琼脂培养基间仅加一层滤纸，且无液体培养基）下外植体上的农杆菌生长量最小（平均为 6CFU/切块），但切块的转绿率为45. 63 %，平均鲜重为13mg/个，统计学分析差异达显著水 平。由此可见本发明方法中液体共培养基浸润的3层滤纸（方法III，也即实施例1中的共 培养方法）既可W有效地控制农杆菌的生长，液体培养基又可W与外植体充分接触，提高 细胞的活力和增殖能力，有利于外植体生长。
[0102] 共培养后对GUS基因瞬时表达检测发现，方法III条件下，具GUS阳性细胞团的子叶 切块比率为66.67%，显著高于方法I下的37. 78%和方法II下的22. 22% (图W。而且单 一切块上的藍色细胞团数由常规方法I下的最高3-4团提高到最高14团。尤其重要的是， 不像方法I、方法II中，藍色GUS阳性细胞分布区域与不定芽形成区域细胞重叠性很差，方 法III中，转化细胞团与再生细胞团重叠性好（图4)，从而大大有利于转化细胞的不定芽形 成，对提高转化率至关重要。
[0103] 实施例6筛选培养条件对转基因西瓜转化率的影响
[0104] 本实施例对筛选培养条件中采用梯度筛选剂的方法（即为方法二，具体采用实施 例1的方法进行），和筛选前期即外植体转入筛选培养基后3-4周不使用筛选压，筛选后 期即外植体有球形愈伤形成并开始分化出芽时使用较高筛选压的方法，本实施例称为方法 一）进行了对比试验。
[0105] 结果说明本发明的梯度筛选方法（方法二）使不定芽中的逃逸体频率从方法一的 91 %降低至26. 3%，对形成植株的进一步GUS染色及PCR鉴定，结果显示筛选方法二再生株 中阳性率达52. 1 %，最终外植体切片的总转化率（阳性植株数/子叶切块数）为18. 7 %， 显著高于方法一筛选下的3. 64%，W及常规恒压筛选下的1%左右。如果按照种子转化率 (阳性植株数/种子数）计，本方案下高达126. 6%。
[0106] W上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可W做出若干改进和润饰，该些改进和润饰 也应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种转基因西瓜植株的制备方法，包括以下步骤： (1) 含外源目的基因的农杆菌菌液侵染西瓜成熟子叶外植体； (2) 侵染后，将外植体转入共培养基中培养，所述共培养基为三层无菌滤纸，加入液体 共培养基浸透滤纸；外植体置于滤纸之上共培养； (3) 共培养结束后，将步骤（2)的外植体转移到含低浓度筛选剂的筛选培养基上进行 筛选培养，之后逐渐提高筛选剂的浓度进行筛选培养，挑选抗性外植体； (4) 将抗性外植体幼芽转入芽伸长培养基继续筛选，取生长良好的完整幼苗，转入生根 培养基，幼苗生根后炼苗、移栽，得到转基因西瓜植株。2. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1)所述的西瓜子叶外植体获得方 法为：取健康饱满的西瓜种子，剥去种皮，避免伤及种仁，用70%乙醇溶液消毒3〇 sec，无菌 水清洗；有效氯浓度为〇. 2% -0. 3%的次氯酸钠溶液消毒10-15min，无菌水清洗后接入BM 培养基，28°C暗培养3天，切取健康萌动的种仁，自子叶近轴端，I. 5_X I. 5_切片，及时接 入MS液体培养基中。3. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1)侵染方法为将0D600为 0. 8-1. 0的含外源基因的农杆菌菌液与西瓜子叶外植体混匀，侵染lOmin。4. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2)所述的共培养是在28°C黑暗 条件下培养4天。5. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2)所述液体共培养基的配 方为 1650mg/L NH4N03,19 00mg/L KN03，170mg/L KH2P04,370mg/L MgSO4.7H20,332mg/L CaCl2, 223mg/L MnSO4. 4H20, 6. 2mg/L H3BO3, 8. 6mg/L ZnSO4. 7H20,0. 83mg/L KI,0. 025mg/ L Na2MoO4. 2H20,0.025mg/L CuSO4. 5H20,0.025mg/L CoCl2. 6H20, 27. 8mg/L FeSO4. 7H20 37. 3mg/L EDTA. Na2, lOOOmg/L 肌醇，5mg/L 烟酸，Smg/LVBp 0? 5mg/L VB6,1. 5mg/L6-BA，30g/ L鹿糖，pH5. 8,高压灭菌。6. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2)的加入液体共培养基的量应 同时满足以下条件，即刚好浸润滤纸且无多余液体流出并保证28°C共培养4天后滤纸不干 涸。7. 如权利要求1-6任一所述的制备方法，其特征在于，步骤（3)的具体方法为，共培养 结束后，选择正常膨大的黄色子叶切片外植体直接转入含3-3. 5mg/L草铵膦和300mg/L羧 苄青霉素的筛选培养基，筛选培养2-3周后，将抗性外植体转入含4. 5-5. 5mg/L草铵膦和 300mg/L羧苄青霉素的筛选培养基，继续筛选培养2-3周，当抗性外植体在切口边缘有绿色 瘤状愈伤生成并分化出不定芽时，将不定芽切下转入含6. 5-7. 5mg/L草铵膦和300mg/L羧 苄青霉素的筛选培养基继续培养2-3周。8. 如权利要求1-6任一所述的制备方法，其特征在于，步骤（3)的具体方法为，共培养 结束后，选择正常膨大的黄色子叶切片外植体直接转入含3mg/L草铵膦和300mg/L羧苄青 霉素的筛选培养基，筛选培养2周后，将抗性外植体转入含5mg/L草铵膦和300mg/L羧苄青 霉素的筛选培养基，继续筛选培养2周，当抗性外植体在切口边缘有绿色瘤状愈伤生成并 分化出不定芽时，将不定芽切下转入含7mg/L草铵膦和300mg/L羧苄青霉素的筛选培养基 继续培养2周。9. 如权利要求1-6所述的制备方法，其特征在于，步骤（4)将抗性外植体幼芽转入芽伸 长培养基继续筛选2-3周，每周继代一次，将不定芽基部残留外植体和瘤状愈伤逐渐切除， 使芽与培养基充分接触。10.权利要求1-9任一所述的制备方法在西瓜遗传改良及育种中的应用。
【专利摘要】本发明提供了一种转基因西瓜植株的制备方法，属于转基因植物制备领域。该方法是利用转入外源基因的农杆菌侵染西瓜成熟子叶外植体；之后转入共培养基上培养，所述共培养基是由3层无菌滤纸和适量的液体共培养基组成；之后外植体转入筛选培养基，前期使用较低浓度的筛选剂，后期逐渐提高筛选剂浓度，经过芽伸长筛选、生根、炼苗、移栽，得到转入外源基因的西瓜植株，分子鉴定结果显示外源基因成功转入并能稳定表达。本发明方法提高外植体细胞活力，转化细胞数目多，转化细胞与再生细胞重叠性好，逃逸体频率低，转化率高，转基因植株生长健壮，生根好，驯化存活率高，适用于不同外源基因及农杆菌菌株类型转化，且重复性良好，具有良好的经济价值。
【IPC分类】A01H5/00, C12N15/84
【公开号】CN104988177
【申请号】CN201510355406
【发明人】宗梅, 刘凡, 王桂香, 许勇, 郭宁, 韩硕, 张月云
【申请人】北京市农林科学院
【公开日】2015年10月21日
【申请日】2015年6月24日