一种检测绿原酸的方法及其专用酶联免疫试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测绿原酸的方法及其专用酶联免疫试剂盒，属于生物技术领 域。
【背景技术】
[0002] 绿原酸（Chlorogenic acid，CGA)是由咖啡酸和奎宁酸组成的酚酸类化合物，具 有抗氧化、抗炎、抑菌杀菌、心肌保护、抗血栓等多种药理活性。绿原酸存在于多种药用植 物中，2010版《中国药典》以绿原酸含量作为金银花（Lonicerae japonicae FLOS)、山银花 (Lonicerae FLOS)、杜仲叶（Eucommiae FOLIUM)等中药材质量评价指标性成分之一。
[0003] 目前，绿原酸检测方法有薄层色谱法、高效液相色谱法、液质联用检测法、毛细管 电泳检测法等，但上述方法均无法同时满足简单快速、高通量、现场检测的需求。酶联免疫 吸附检测法具有操作简便、灵敏度高、通量高、检测快速、成本低廉等特点，在中药材的品质 鉴定方面应用广泛。
[0004] 金银花是常用大宗药材之一，市场需求量大，但由于金银花种质、生境、采收加工、 储藏条件等诸多差异，导致金银花药材质量参差不齐，严重影响金银花药用疗效及其他商 业产品开发应用，所以建立一种简便、快速、高通量的绿原酸免疫检测方法对金银花等中药 材的质量控制具有非常重要的意义。
【发明内容】
[0005] 本发明的第一个目的是提供抗绿原酸的单克隆抗体。
[0006] 本发明提供的抗绿原酸的单克隆抗体的保藏号为CGMCC No. 10880的杂交瘤细胞 株分泌的。
[0007] 本发明的第二个目的是提供一株分泌抗绿原酸的单克隆抗体的杂交瘤细胞株 CGAlD7〇
[0008] 本发明提供的分泌抗绿原酸的单克隆抗体的杂交瘤细胞株CGA1D7的保藏号为 CGMCC No. 10880。
[0009] 本发明保护保藏号为CGMCC No. 10880的杂交瘤细胞株CGA1D7,该杂交瘤细胞株 的分类命名为小鼠杂交瘤细胞系，该杂交瘤细胞株已于2015年6月2日保藏于中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3 号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No. 10880。
[0010] 本发明的第三个目的是提供上述单克隆抗体或上述杂交瘤细胞株CGA1D7的新用 途。
[0011] 本发明提供了上述单克隆抗体或上述杂交瘤细胞株CGA1D7在检测或辅助检测待 测样品中绿原酸含量中的应用。
[0012] 本发明还提供了上述单克隆抗体或上述杂交瘤细胞株CGA1D7在制备检测或辅助 检测待测样品中绿原酸含量的试剂或试剂盒中的应用。
[0013] 本发明还提供了上述单克隆抗体或上述杂交瘤细胞株CGA1D7在制备检测或辅助 检测待测样品中绿原酸含量的胶体金试纸条中的应用。
[0014] 本发明还提供了上述单克隆抗体或上述杂交瘤细胞株CGA1D7在比较或辅助比较 待测样品中绿原酸含量高低中的应用。
[0015] 本发明的第四个目的是提供一种检测或辅助检测待测样品中绿原酸含量的酶联 免疫试剂盒。
[0016] 本发明提供的检测或辅助检测待测样品中绿原酸含量的酶联免疫试剂盒包括独 立包装的上述单克隆抗体。
[0017] 本发明提供的检测或辅助检测待测样品中绿原酸含量的酶联免疫试剂盒还可含 有分别为独立包装的绿原酸标准品和/或用于标记所述单克隆抗体的标记酶；
[0018] 所述绿原酸标准品可为绿原酸或由所述绿原酸配制成的一系列不同浓度的绿 原酸溶液；所述一系列不同浓度的绿原酸溶液的浓度具体可为：4 n g /mL、2 n g /mL、I n g /mL、 0· 5ng/mL、0. 25ng/mL、0. 125ng/mL和0· 0625ng/mL ;所述绿原酸溶液的溶剂具体可为PBS缓 冲液；所述PBS缓冲液的溶剂为水，溶质为Na2HP04、KH 2PO4和NaCl，溶质Na 2HP04、KH2POjP NaCl在所述PBS缓冲液中的浓度分别为0. 02M、0. 0015M和0. 14M，pH值为7. 5 ;
[0019] 所述标记酶具体可为辣根过氧化物酶。
[0020] 本发明提供的检测或辅助检测待测样品中绿原酸含量的酶联免疫试剂盒还可含 有分别为独立包装的包被缓冲液和/或洗涤液和/或底物缓冲液和/或终止缓冲液和/或 封闭液；
[0021 ] 所述包被缓冲液的溶剂为水，溶质为Na2COjP NaHCO 3;溶质Na 20)3和NaHCO 3在所 述包被缓冲液中的浓度分别为〇. OlM和0. 04M ;所述包被缓冲液的pH值为9. 6 ;
[0022] 所述洗涤液的溶剂为水，溶质为Na2HP04、KH 2P04、NaCl和吐温-20 ;溶质Na2HP04、 KH2P04、NaCl和吐温-20在所述洗涤液中的浓度分别为0. 02M、0. 0015M、0. 14M和0. 1% (体 积百分含量）；所述洗涤液的pH值为7. 5 ;
[0023] 所述底物缓冲液的溶剂为水，溶质为柠檬酸三钠和Na2HPO4;溶质柠檬酸三钠和 Na2HPO4在所述底物缓冲液中的浓度分别为0.0 lM和0. 03M ;所述底物缓冲液的pH值为 5. 5 ；
[0024] 所述终止缓冲液为2M的硫酸水溶液；
[0025] 所述封闭液的溶剂为水，溶质为Na2HP04、KH 2P04、NaCl和脱脂牛奶；溶质Na2HP04、 KH2P04、NaCl和脱脂牛奶在所述封闭液中的浓度分别为0. 02M、0. 0015M、0. 14M和3% (质量 百分含量）；所述封闭液的pH值为7. 5。
[0026] 上述酶联免疫试剂盒中，所述样品为金银花。
[0027] 上述酶联免疫试剂盒在检测或辅助检测待测样品中绿原酸含量中的应用也属于 本发明的保护范围。
[0028] 上述应用中，所述样品为金银花。
[0029] 本发明提供了一种检测绿原酸的方法及其专用酶联免疫试剂盒。本发明所提供 的酶联免疫试剂盒包括抗绿原酸的单克隆抗体，该抗绿原酸的单克隆抗体是通过间接竞争 ELISA方法筛选出的杂交瘤细胞株CGMCC No. 10880分泌的。通过实验证明：本发明所提供 抗绿原酸的单克隆抗体特异性强，对隐绿原酸的交叉反应率为1. 926% ;对新绿原酸的交叉 反应率为4. 870%;对异绿原酸A的交叉反应率为17. 533%;对异绿原酸B的交叉反应率为 0. 364% ;对异绿原酸C的交叉反应率为0. 776% ;对咖啡酸的交叉反应率为0. 010% ;对奎 尼酸、肉桂酸、阿魏酸、1，3-二咖啡奎尼酸的交叉反应率均小于0. 001 %;利用该单克隆抗体 制备得到的间接竞争酶联免疫试剂盒可用于定性或定量检测植物样品中的绿原酸，线性检 测范围在0. 102~I. 506ng/mL，具有快速、灵敏的优点。
【附图说明】
[0030] 图1为绿原酸的化学结构。
[0031 ]图2为酶联免疫试剂盒检测绿原酸浓度的标准曲线。
【具体实施方式】
[0032] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0033] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0034] 弗氏完全佐剂=Sigma公司，产品目录编号为F5881。
[0035] 弗氏不完全佐剂：Sigma公司，产品目录编号为F5506。
[0036] 绿原酸标准品溶液：将绿原酸溶于PBS缓冲液后得到的溶液。
[0037] PBS 缓冲液：溶剂为水，溶质为 Na2HP04、KH2P0# NaCl，溶质 Na2HP04、KH2P0# NaCl 在PBS缓冲液中的浓度分别为0. 02M、0. 0015M和0. 14M ;pH值为7. 5。
[0038] 包被缓冲液：溶剂为水，溶质为Na2COjP NaHCO 3;溶质Na 20)3和NaHCO 3在包被缓冲 液中的浓度分别为0.0 lM和0. 04M ;pH值为9. 6。
[0039] 洗涤液：溶剂为水，溶质为 Na2HP04、KH2P04、NaCl 和吐温-20 ;溶质 Na2HP04、ΚΗ2Ρ04、 NaCl和吐温-20在洗涤液中的浓度分别为0. 02M、0. 0015M、0. 14M和0.1 % (体积百分含 量）；pH值为7. 5。
[0040] 样品稀释液：溶剂为水，溶质为Na2HP04、KH 2POjP NaCl、吐温-20和明胶；溶质 Na2HP04、KH2P0# NaCl在样品稀释液中的浓度分别为(λ 02Μ、(λ 0015M和(λ 14M ;吐温-20在 样品稀释液中的体积百分含量为〇. 1% ;明胶在样品稀释液中的质量百分含量为〇. 5%。
[0041] 底物缓冲液：溶剂为水，溶质为柠檬酸三钠和Na2HPO4;溶质柠檬酸三钠和Na 2ΗΡ04 在底物缓冲液中的浓度分别为〇. OlM和0. 03Μ ;ρΗ值为5. 5。
[0042] 终止缓冲液：浓度为2Μ的硫酸水溶液。
[0043] 封闭液：溶剂为水，溶质为Na2HP04、KH2P0 4、NaCl和脱脂牛奶；溶质Na2HP04、KH2P0 4、 似(：1和脱脂牛奶在封闭液中的浓度分别为0.021、0.00151、0.141和3%(质量百分含量）； pH值为7. 5。
[0044] Bal b/C小白鼠购自军事医学科学院实验动物中心。
[0045] SP2/0骨髓瘤细胞购自中国兽医药品监察所。
[0046] 实施例1、杂交瘤细胞株的获得及抗绿原酸单克隆抗体的制备
[0047] -、绿原酸-BSA免疫原和绿原酸-OVA包被原的合成
[0048] 1、称取绿原酸标准品（购自中国食品药品检定研究院，广品目录编号为110753， 化学结构式见图l)l〇mg，溶解于2mL无水N，N-二甲基甲酰胺（购自Sigma公司，产品目录 编号为D4551)中，常温下磁力搅拌，得到绿原酸标准品溶液。
[0049] 2、向步骤1中的绿原酸标准品溶液中加入3. Omg N-羟基琥珀酰亚胺（购自S