ng/ mL;奎尼酸溶液的浓度分别为：40 000ng/mL、20 000ng/mL、10 000ng/mL、5 000ng/mL、2 500ng/mL、I 250ng/mL和625ng/mL ;对照孔为50 μ L的样品稀释液。
[0089] 3、加抗体
[0090] 每孔加入50 μ L实施例1中的步骤五的2得到的抗绿原酸单克隆抗体溶液的稀 释液（用样品稀释液稀释成500ng/mL);每种稀释液设置三个复孔；置湿盒中37°C条件下 30min，洗板4次。
[0091] 4、加酶标二抗
[0092] 将羊抗鼠酶标二抗IgG-HRP (0· lmg/mL，购自Jackson公司，商品目录号为79556) 稀释1000倍，每孔加100 μ L，置湿盒中37°C条件下30min，洗板4次。
[0093] 5、显色
[0094] 取20mg邻苯二胺（OPD)溶于IOmL底物稀释液中，加4 μ L 30% H2O2，将底物溶液 加入酶标板中，每孔100 μ L。避光显色15min。
[0095] 6、终止
[0096] 每孔加入50 μ L终止液，用酶标仪492nm处测定各孔的OD值。
[0097] 以化合物溶液浓度为横坐标，0D/0DJ0D值表示含有化合物时的吸光值，0D。表示 不含有化合物时的吸光值）为纵坐标，运用OriginPro 8软件分别计算绿原酸、隐绿原酸、 新绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、咖啡酸、奎尼酸、阿魏酸、肉桂酸和1，3-二 咖啡奎尼酸的IC 5。值，按下列公式计算交叉反应率：交叉反应率（％) = (IC5。（绿原酸）/ IC5。（绿原酸类似物））X 100 %。
[0098] 结果如表2所示：实施例1中的步骤五的2得到的抗绿原酸单克隆抗体对隐绿原 酸的交叉反应率为1. 926% ;对新绿原酸的交叉反应率为4. 870% ;对异绿原酸A的交叉反 应率为17. 533% ;对异绿原酸B的交叉反应率为0. 364% ;对异绿原酸C的交叉反应率为 0. 776%;对咖啡酸的交叉反应率为0. 010%;对奎尼酸、肉桂酸、阿魏酸、1，3-二咖啡奎尼酸 的交叉反应率均小于〇. 001% ;而对绿原酸的交叉反应率为100%，说明抗绿原酸单克隆抗 体特异性强。
[0099] 表2单克隆抗体与绿原酸及其结构类似物的交叉反应
[0102] 实施例3、单克隆抗体的灵敏度检测
[0103] 通过间接竞争ELISA实验建立标准曲线，并确定检测灵敏度为0. 39ng/mL，线性检 测范围在0. 10~I. 51ng/mL。具体方法如下：
[0104] 1、包被：取96孔酶标板，采用绿原酸-OVA溶液进行包被，100 μ L/孔；绿原酸-OVA 溶液的浓度为500ng/mL ;37°C包被3h，用洗涤液洗涤4次。
[0105] 2、加标准品溶液：每孔加入50 μ L绿原酸标准品溶液，绿原酸标准品溶液浓度依 次为：4ng/mL、2ng/mL、lng/mL、0. 5ng/mL、0. 25ng/mL、0. 125ng/mL 和 0· 0625ng/mL ;对照孔 为50 μ L的样品稀释液。
[0106] 3、加抗体：每孔加入50 μ L步骤五的2得到的单克隆抗体溶液的稀释液（用样品 稀释液稀释成500ng/mL);置湿盒中37°C条件下30min，洗板4次。
[0107] 4、加酶标二抗：将羊抗鼠酶标二抗IgG-HRP (0. lmg/mL，购自Jackson公司，商品目 录号为79556)稀释1000倍，每孔加100 μ L，置湿盒中37°C条件下30min，洗板4次。
[0108] 5、显色：取20mg邻苯二胺（OPD)溶于IOmL底物稀释液中，加4 yL 30% H2O2，将底 物溶液加入酶标板中，每孔100 μ L。避光显色15min。
[0109] 6、终止：每孔加入50 μ L终止液，用酶标仪492nm处测定各孔的OD值。
[0110] 7、绘制标准曲线：以不同浓度的绿原酸标准品溶液为横坐标，B/B。?表示含有绿 原酸时的OD值，B。表示对照孔时的OD值）为纵坐标，运用OriginPro 8软件绘制标准曲 线。实验设3次重复，取三次实验结果的平均值，得到的标准曲线如图2所示。标准曲线方 程为 y = 〇· 01096+0. 97438Λ?+(χ/0· 39623Γ1. 06671) (R2= 0· 9988)。
[0111] 8、根据步骤7建立的标准曲线，定义Β/Β。数值为0. 5时对应的绿原酸标准品浓度 为检测灵敏度（即0. 39ng/mL)，定义Β/Β。数值分别为0. 2和0. 8时所对应的绿原酸标准品 浓度范围为该检测方法的线性检测范围（即0. 10~I. 51ng/mL)。
[0112] 实施例4、检测绿原酸的酶联免疫试剂盒及其应用
[0113] -、试剂盒的制备
[0114] 本发明的检测绿原酸的酶联免疫试剂盒由绿原酸-OVA溶液（包被原）、抗绿原酸 的单克隆抗体、羊抗鼠酶标二抗IgG-HRP、包被缓冲液、洗涤液、标准品溶液、底物缓冲液和 终止缓冲液和封闭液组成。其中，绿原酸-OVA溶液为实施例1中的步骤一制备得到的；抗 绿原酸的单克隆抗体为实施例1的步骤五中的2制备得到的。
[0115] 二、抗绿原酸的单克隆抗体在检测样品中绿原酸含量上的应用
[0116] 使用步骤一的试剂盒对待测样品（不同产地的金银花）中的绿原酸含量进行检 测，具体步骤如下：
[0117] 1、将待测样品粉碎，经50%甲醇超声提取，得到提取液，将提取液直接检测或加适 量样品稀释液稀释成样品溶液。
[0118] 2、包被：取96孔酶标板，采用绿原酸-OVA溶液进行包被，100 μ L/孔；绿原酸-OVA 溶液的浓度为500ng/mL ;37°C包被3小时，用洗涤液洗涤4次。
[0119] 3、加标准品溶液和待测样品溶液：每孔加入50 μ L绿原酸标准品溶液和待测样 品溶液；绿原酸溶液浓度为：4ng/mL、2ng/mL、lng/mL、0. 5ng/mL、0. 25ng/mL、0. 125ng/mL 和 0. 0625ng/mL ;对照孔为50 μ L的样品稀释液。
[0120] 4、加抗体：每孔加入50 μ L单克隆抗体溶液的稀释液（用样品稀释液稀释成 500ng/mL);置湿盒中37°C条件下30min，洗板4次。
[0121] 5、加酶标二抗：将羊抗鼠酶标二抗IgG-HRP (0. lmg/mL，购自Jackson公司，商品目 录号为79556)稀释1000倍，每孔加100 μ L，置湿盒中37°C条件下30min，洗板4次。
[0122] 6、显色：取20mg邻苯二胺（OPD)溶于IOmL底物稀释液中，加4 μ L 30% H2O2，将 底物溶液加入酶标板中，每孔100 μ L。避光显色15min。
[0123] 7、终止：每孔加入50 μ L终止液，用酶标仪492nm处测定各孔的OD值。
[0124] 8、绘制标准曲线：以不同浓度的绿原酸溶液为横坐标，B/B。?表示含有绿原酸时 的OD值，B。表示对照孔的OD值）为纵坐标，运用OriginPro 8软件绘制标准曲线。实验 设3次重复，取三次实验结果的平均值，得到的标准曲线如图2所示。标准曲线方程为y = 0. 01096+0. 97438/(1+(χ/0. 39623) '1. 06671) (R2= 0. 9988) 〇
[0125] 9、将待测样品的B/B。代入标准曲线中，根据标准曲线方程计算得到待测样品中绿 原酸的含量，检测结果见表3。
[0126] 表3、不同产地金银花样品中绿原酸含量检测结果
【主权项】
1. 抗绿原酸的单克隆抗体，由保藏号为CGMCC No. 10880的杂交瘤细胞株分泌的。2. -株分泌抗绿原酸的单克隆抗体的杂交瘤细胞株CGAID 7，其保藏号为CGMCC No.10880。3. 权利要求1所述的单克隆抗体或权利要求2所述的杂交瘤细胞株CGA1D7在检测或 辅助检测待测样品中绿原酸含量中的应用。4. 权利要求1所述的单克隆抗体或权利要求2所述的杂交瘤细胞株CGA1D7在制备检 测或辅助检测待测样品中绿原酸含量的试剂或试剂盒中的应用。5. 权利要求1所述的单克隆抗体或权利要求2所述的杂交瘤细胞株CGA1D7在制备检 测或辅助检测待测样品中绿原酸含量的胶体金试纸条中的应用。6. 权利要求1所述的单克隆抗体或权利要求2所述的杂交瘤细胞株CGA1D7在比较或 辅助比较待测样品中绿原酸含量高低中的应用。7. -种检测或辅助检测待测样品中绿原酸含量的酶联免疫试剂盒，包括独立包装的权 利要求1所述的单克隆抗体。8. 根据权利要求7所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述样品为金银花。9. 权利要求7或8所述的酶联免疫试剂盒在检测或辅助检测待测样品中绿原酸含量中 的应用。10. 根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述样品为金银花。
【专利摘要】本发明公开了一种检测绿原酸的方法及其专用酶联免疫试剂盒。本发明的专用酶联免疫试剂盒所使用的抗绿原酸的单克隆抗体是由杂交瘤细胞株CGMCC？No.10880分泌产生的。通过实验证明：本发明所提供抗绿原酸的单克隆抗体特异性强，对隐绿原酸的交叉反应率为1.926％；对新绿原酸的交叉反应率为4.870％；对异绿原酸A的交叉反应率为17.533％；对异绿原酸B的交叉反应率为0.364％；对异绿原酸C的交叉反应率为0.776％；对咖啡酸的交叉反应率为0.010％。利用该单克隆抗体制备得到的酶联免疫试剂盒可用于定性或定量检测样品中绿原酸，线性检测范围在0.10～1.51ng/mL，具有快速、灵敏的优点。CGMCC No. 1088020150602
【IPC分类】C07K16/44, G01N33/577, C12N5/20, C12R1/91
【公开号】CN105017426
【申请号】CN201510437984
【发明人】黄璐琦, 张波, 南铁贵, 袁媛, 詹志来, 康利平
【申请人】中国中医科学院中药研究所
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2015年7月23日