)，2957. 45 (-CH3)， 1436. 00(d-0CH3)，1612. 55, I486. 25 (C = C)，3007. 07, 857. 70 (C-H, Ar)。分析结果可知， DMP半抗原中间体4-硝基邻苯二甲酸二甲酯的-NO2的不对称伸缩振动（V asNJ的吸收带 出现在1533. Ilcm 1附近，对称伸缩振动（V s N(]2)的吸收带出现在1353. 56cm 1附近；此外， 芳酸酯v。=。吸收峰明显出现在1731.81cm 1处，邻苯二甲酸酯的伸缩振动的双带出现在 1294. 64和1130. 93cm 1处；芳核的两个V吸收带出现在1612. 55和1486. 25cm 1处，这 说明反应产物4-硝基邻苯二甲酸二甲酯中具备苯环、甲氧基、硝基基官能团的结构特征。
[0065]实施例5、邻苯二甲酸二甲醅半抗原的制备
[0066] 称取1.5g(0.0063mol)DMP半抗原中间体（4-硝基邻苯二甲酸二甲酯）装入容 积为500mL三口圆底烧瓶底部，随后向瓶底边搅拌边加入315mL(3. 5432mol)苯，待4-硝 基邻苯二甲酸二甲酯被苯溶解后再加入4. lg(0.0630mol)纯锌粉，搅拌均匀后分次加入 11.25mL 浓 HC1(0. 1350mol)，25°C搅拌 15min 后再次加入 4. lg(0. 0630mol)纯锌粉，搅拌反 应15h，薄板层析法（TLC)监测反应直至反应完全；反应结束后，将410mL冷水加入反应体 系，并用IM NaOH溶液中和至弱碱性（pH 7. 0-8.5);静置Ih后分离并保留苯层，再用苯萃 取水层，合并萃取液，有机相经水洗后用无水Na2SOJ^水干燥以除去多余的水分；有机相减 压蒸馏以除去苯，得到的粗品再用硅胶柱层析（洗脱剂为乙酸和正己烷的混合液（V/V = 1:8))后减压蒸馏，得到淡黄色晶体4-氨基邻苯二甲酸二甲酯即DMP半抗原。邻苯二甲酸 二甲酯半抗原分子式=C 1idH11NO4;分子量209. 20 ;产率52. 6% ;熔点：79~81°C，纯度99%。
[0067]实施例6、邻苯二甲酸二甲醅半抗原的制备
[0068] 称取1.5g(0. 0063mol)DMP半抗原中间体（4-硝基邻苯二甲酸二甲酯）装入容 积为500mL三口圆底烧瓶底部，随后向瓶底边搅拌边加入315mL(3. 5432mol)苯，待4-硝 基邻苯二甲酸二甲酯被苯溶解后再加入4.51g(0.0693mol)纯锌粉，搅拌均匀后分次加入 11. 55mL 浓 HCl (0? 1386mol)，28 °C 搅拌 15min 后再次加入 4. 51g(0. 0693mol)，搅拌反应 12h，薄板层析法（TLC)监测反应直至反应完全；反应结束后，将410mL冷水加入反应体系， 并用IM NaOH溶液中和至弱碱性（pH 7. 0-8.5);静置Ih后分离并保留苯层，再用苯萃取水 层，合并萃取液，有机相经水洗后用无水Na2SOJ^水干燥以除去多余的水分；有机相减压蒸 馏以除去苯，得到的粗品再用硅胶柱层析（洗脱剂为乙酸和正己烷的混合液（V/V= 1:8)) 后减压蒸馏，得到淡黄色晶体4-氨基邻苯二甲酸二甲酯即DMP半抗原。邻苯二甲酸二甲酯 半抗原分子式=C 1idH11NO4;分子量209. 20 ;产率54. 8 % ;熔点：79~81 °C，纯度99%。
[0069] 实施例7、邻苯二甲酸二甲醅半抗原的制备
[0070] 称取1.5g(0.0063mol)DMP半抗原中间体（4-硝基邻苯二甲酸二甲酯）装入容 积为500mL三口圆底烧瓶底部，随后向瓶底边搅拌边加入315mL(3. 5432mol)苯，待4-硝 基邻苯二甲酸二甲酯被苯溶解后再加入4.31g(0.0662mol)纯锌粉，搅拌均匀后分次加入 11. 03mL 浓 HCl (0? 1323mol)，27°C搅拌 15min 后再次加入? 31g (0? 0662mol)，搅拌反应 13h， 薄板层析法（TLC)监测反应直至反应完全；反应结束后，将410mL冷水加入反应体系，并用 IM NaOH溶液中和至弱碱性（pH 7. 0-8.5);静置Ih后分离并保留苯层，再用苯萃取水层，合 并萃取液，有机相经水洗后用无水Na2SOJ^水干燥以除去多余的水分；有机相减压蒸馏以 除去苯，得到的粗品再用硅胶柱层析（洗脱剂为乙酸和正己烷的混合液（V/V = 1:8))后减 压蒸馏，得到淡黄色晶体4-氨基邻苯二甲酸二甲酯即DMP半抗原。邻苯二甲酸二甲酯半抗 原分子式：CiqH11NO4;分子量209. 20 ;产率55. 1% ;恪点：79~81°C，纯度99%。
[0071] 实施例8、邻苯二甲酸二甲醅半抗原的表征
[0072] 获得的DMP半抗原，其结构通过核磁共振、红外光谱、紫外光谱等检测手 段分析鉴定，DMP半抗原中间体的红外光谱如图2所示，其特征如下：IR(KBr) V/ cm 1Z 3565. 49 (-NH2)，1715. 69 (C = 0)，1299. 00, 1069. 76 (C-O-C)，2923. 28 (-CH3)， 1436. 56 (d-0CH3),1631. 05, 1605. 36 (C = C) cm \ 1193. 53, 960. 27, 709. 58 (C-H, Ar)〇分 析结果可知4-氨基邻苯二甲酸二甲酯的伯胺的N-H键的不对称伸缩振动（v as N H)的吸 收带出现在3565. 49cm1附近，这已充分证实硝基已经被还原成氨基；此外，芳酸酯v c =。 吸收峰明显出现在在1715. 69cm1处，邻苯二甲酸酯的伸缩振动的双带出现在1299. 00和 1069. 76cm1处；芳核的两个V吸收带出现在1631. 05和1605. 36cm 1处，这说明反应产 物中具备苯环、甲氧基、氨基官能团的结构特征。
[0073] DMP半抗原的核磁共振氢谱图如图3所示，其特征如下=1H NMR(400MHz，⑶Cl3): 8 7. 67 (d, 1H, ArH), 6. 67 (dd, 1H, ArH), 6. 62 (d, 1H, ArH), 4. 28 (d, 2H, -NH2), 3. 86 (s, 3H, -〇-CH3)，3.79(s，3H，-0-CH3)ppm。从中可明显看出：苯环上引入氨基偶联臂后，S4.17处出现 氨基氢，波谱图中出现的氢原子的位置和个数与所合成的半抗原4-氨基邻苯二甲酸二甲 酯结构相符。
[0074] 实施例9、邻苯二甲酸二甲醅人工全抗原的制备
[0075] 本发明制备的邻苯二甲酸二甲酯半抗原，主要应用在环境中邻苯二甲酸二甲酯的 免疫检测中。它的主要用途之一，就是可以用来直接和蛋白质大分子偶联，制备出用来免疫 动物的免疫原，进而制备出相应的单克隆或多克隆抗体。在此基础上建立邻苯二甲酸二甲 酯的免疫测定方法。下面就邻苯二甲酸二甲酯半抗原的使用做以下应用举例：
[0076]采用重氮化法制备DMP免疫原DMP-BSA，具体合成步骤：将0. 0209g (0. lmmol) DMP 半抗原装入容积为25mL的锥形瓶中，边滴加0. 75mL H2O边搅拌，混合后再加入0. 025mL浓 HC1，待混合物加热溶解后置冰浴中冷却；随后，在4°C低温搅拌的情况下，逐滴滴加IM亚 硝酸钠溶液，用PH试纸控制反应酸度为2. 0-3. 0,同时用淀粉碘化钾试纸显色，显色时间 为滴加后的l_3s，试纸由白色瞬间变成灰蓝色时停止滴加，再继续反应30min，加2. Og尿 素以去除未反应的亚硝酸钠；然后，向上述重氮盐中逐滴加入0.08mM BSA溶液（0.0 lM pH 9. 18硼酸钠缓冲液溶解），直至溶液逐渐呈橙红色，继续反应2h后，将得到的抗原粗品装 入透析袋，置于〇. OlM pH7. 40磷酸盐缓冲液中透析3d，每隔8h换水1次，最后将终产物 4000r ? min 1离线15min，取其上清液即DMP免疫原DMP-BSA。免疫原经紫外-可见分光光 度计鉴定后，小量分装，_20°C冷冻干燥、分装并于_20°C保存。
[0077] 通过戊二醛法制备DMP包被原DMP-0VA，具体合成步骤：将0. 0209g (0. lmmol) DMP 半抗原装入容积为25mL的锥形瓶中，边滴加lmLN，N-二甲基甲酰胺（DMF)边搅拌，搅拌均 匀后再逐滴加入到0. 08mM OVA溶液（0.0 lM pH 7. 40磷酸盐缓冲液溶解）IOmL中，随后向 该混合体系中缓慢加入0. 〇36mL 25%戊二醛，4°C低温闭光搅拌反应24h后，将得到的抗原 粗品装入透析袋，置于0.0 lM pH 7. 40磷酸盐缓冲液中低温4°C透析3d，每隔8h换水