TA识别序列。这些片段可通过用限 制性酶切割本文披露的天然存在的启动子核苷酸序列、通过合成来自启动子DNA序列 的天然存在的序列的核苷酸序列、或通过使用PCR技术来获得。特别参见穆利斯等人 (1987)酶学方法 155:335-350(Mullisetal.(1987)MethodsEnzymol. 155:335-350)以 及埃尔利赫编（1989)PCR技术（纽约斯托克顿出版社）（Mullisetal. (1987)Methods Enzymol. 155:335-350,andErlich,ed. (1989)PCRTechnology(StocktonPress1New York)。这些启动子片段的变体，例如由定点诱变形成的那些变体，也包括在本发明的组合 物中。
[0026] 本文所披露的启动子序列的变体也包括在其中。"变体"是指足够相同的序列。本 发明包括的启动子序列与SEQIDN0:1或2的核苷酸序列足够相同。"足够相同"是指使用 如本文所述的比对程序中之一与参考序列相比，核苷酸序列具有至少大约70%或75%、大 约80%或85%的序列一致性、大约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99 %的序列一致性。
[0027] 通过使用众所周知的分子生物学技术，例如聚合酶链式反应（PCR)和如下文概述 的杂交技术，可以识别天然存在的变体。核苷酸序列变体还包括通过合成衍生的核苷酸序 列，这些通过合成衍生的核苷酸序列如通过使用定点诱变产生，但是仍具有本文限定的启 动子活性的核苷酸序列。
[0028] 本发明所包括的变体具有生物活性，即其继续拥有天然序列所需的生物活性，即， 保留启动子活性（即，启动转录）。"保留启动子活性"是指变体将具有天然序列的启动子 活性的至少大约30%、至少大约50%、至少大约70%或至少大约80%或更高。用于测定启 动子活性的方法是本领域中所公知的。适当方法的实例，参见题为"启动子活性评估"的部 分。
[0029] 熟练的业内人士将进一步了解，通过突变可以改变本发明的核苷酸序列，而不改 变启动子在植物细胞中的驱动表达的能力。因而，通过将一个或多个核苷酸取代、添加或缺 失引入本文所披露的相应核苷酸序列中，可以产生分离的核酸分子变体。通过标准技术，例 如定点诱变和PCR-介导的诱变，可以引入突变。这些核苷酸序列变体也包括在本发明中。
[0030] 作为替代方案，通过沿着全部或部分的启动子序列随机引入突变，例如通过饱和 诱变，可以产生核苷酸序列变体，并且在得到的突变体中，可以筛选能够驱动植物细胞中可 操作地连接的核苷酸序列的表达的突变体。
[0031] "可操作地连接"是指启动子和第二序列之间的功能连接，其中启动子序列启动并 介导与第二序列相对应的DNA序列的转录。通常，可操作地连接意味着连接的核酸序列是 毗邻的，且在需要连接两个蛋白编码区时这些连接的核酸序列是毗邻的并处在同一阅读框 中，但并非总是如此。
[0032] 为了确定两个核酸的百分比一致性，对这些序列进行了比对，以达到最佳比较效 果。两个核酸的百分比一致性是这些序列共有相同位置的数目的函数（即，百分比一致性 =相同位置的数目/位置总数（例如，重叠位置）x100)。在一个实施例中，两个序列具有 相同长度。使用与以下所述类似的技术，无论允许或不允许缺口，可以确定两个序列之间的 百分比一致性。在计算百分比一致性时，典型地对精确匹配进行计算。
[0033] 两个序列之间的百分比一致性的确定可以使用数学算法来完成。用于比较 两个序列的数学算法的非限制性实例是卡林和阿特舒尔（1990)美国国家科学院院 刊 87:2264(arlinandAltschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:2264)的算法， 该算法在卡林和阿特舒尔（1993)美国国家科学院院刊90:5873-5877(Karlinand Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5877)中得以改良。将该算法结合到 阿特舒尔等人（1990)分子生物学杂志Biol.215:403)(Altschuletal. (1990)J.M〇1. Biol. 215:403.)的BLASTN程序中。可以用BLASTN程序（分值=100,字长=12)进行 BLAST核苷酸检索，以获得与本发明的启动子同源的核苷酸序列。为了获得有缺口的比对用 于进行比较，如阿特舒尔等人（1997)核酸研究25:3389。（Altschuletal. (1997)Nucleic AcidsRes. 25:3389)所述可利用GappedBLAST。作为替代方案，可用PSI-Blast进行迭代 检索以检测分子间的远源关系。参见上文阿特舒尔等人（1997)(Altschuletal. (1997))。 当利用BLAST、GappedBLAST以及PSI-Blast程序时，可使用相应程序（例如，BLASTN)的 默认参数。参见WWW.ncbi.nlm.nih.gov。用于比较序列的数学算法的另一非限制性实例 是ClustalW算法（希金斯等人（1994)核酸研究 22:4673-4680)(Higginsetal. (1994) NucleicAcidsRes. 22:4673-4680)。ClustalW比较序列并比对DNA序列的整体，因此可 以提供关于完整核苷酸序列的序列保守性的数据。ClustalW算法已被用于几种商业上可 获得的DNA分析软件包中，例如载体NTi程序组（Informax，Inc)的ALIGNX模块。可用于 分析ClustalW比对的软件程序的非限制性实例是GeneDoc?。GeneDoc?(KarlNicholas) 允许评价多个基因之间的DNA相似性和一致性。用于比较序列的数学算法的另一个优选 的、非限制性的实例是米勒和迈尔斯（1988)生物科学中的计算机应用4:ll-17(Myersand Miller(1988)CABI0S4:11-17)的算法。这样的算法被结合到ALIGN程序（2.0版）中，它 是GCG序列比对软件包（可购自美国加利福尼亚州圣地亚哥市9865斯克兰顿路（Scranton Rd.)的阿赛乐德公司（Accelrys，Inc.))的一部分。
[0034] 除非另有说明，使用内德勒曼和翁施（1970)分子生物学杂志 48 (3) : 443-453(NeedlemanandWunsch(1970)J.Mol.Biol. 48 (3) : 443-453)的算法的GAP 版本10,将用于使用如下参数确定序列一致性或相似性：核苷酸序列使用50的缺口权重和 3的长度权重以及nwsgapdna.cmp记分矩阵确定百分比一致性和百分比相似性；核苷酸序 列使用8的缺口权重和2的长度权重以及BL0SUM62记分程序确定百分比一致性和百分比 相似性。也可采用等效程序。"等效程序"是指任何序列比对程序，当与GAP版本10产生的 相应比对相比时，其对任何两个相关序列的对比产生相同的核苷酸残基匹配和相同的百分 序列一致性。
[0035] 使用例如PCR、杂交等方法可以鉴定来自其他生物（特别是其他植物）的相应序 列，这些序列与本发明的序列基本上相同。参见例如，J.萨姆布鲁克和D.W.拉塞尔（2001) 分子克隆：实验手册（纽约冷泉港冷泉港实验室出版社）（SambrookJ.，andRussell,D. ff. (2001)MolecularCloning:ALaboratoryManual.(ColdSpringHarborLaboratory Press，ColdSpringHarbor，NY))以及英尼斯等人（1990)PCR协议：方法和应用指南 (纽约学术出版社）（Innis,etal. (1990)PCRProtocols:AGuidetoMethodsand Applications(AcademicPress,NY))。本发明包括通过其与本文所述启动子序列的一致性 被识别出的序列。
[0036] 可以设计寡核苷酸引物用于PCR反应，以扩增来自目的植物的cDNA或基因组 DNA的相应DNA序列。用于设计PCR引物和PCR克隆的方法是本领域普遍已知的并且披 露在萨姆布鲁克等人（1989)分子克隆：实验手册（第二版，纽约冷泉港冷泉港实验室出 版社）（Sambrooketal. (1989)MolecularCloning:ALaboratoryManual(2ded.，Cold SpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY))中。参见英尼斯等人编 (1990)?0?协议：方法和应用指南（纽约学术出版社）（111111 86丨&1.，6(18.(1990)?0? Protocols:AGuidetoMethodsandApplications(AcademicPress,NewYork));英尼 斯和盖尔芬德编（1995)?0?策略（纽约学术出版社）（1111118&11(1661€ &11(1，6(18.(1995)?0? Strategies(AcademicPress,NewYork));以及英尼斯和盖尔芬德编（1999)PCR方法手 册（纽约学术出版社）（InnisandGelfand，eds. (1999)PCRMethodsManual(Academic Press,NewYork))。已知的PCR方法包括但不限于使用配对引物、巢式引物、单个特异引物、 简并引物、基因特异性引物、载体特异性引物和部分错配的引物的方法。
[0037] 在杂交方法中，已知的全部或部分核苷酸序列可以用于筛选cDNA或基因组文库。 用于构建这些cDNA和基因组文库的方法是本领域普遍已知的，且披露在上文萨姆布鲁克 和拉塞尔，2001(SambrookandRussell, 2001)中。杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA 片段、RNA片段或其他寡核苷酸，且可以标有可检测的基团（例如32P)或其他任何可检测 的标记，例如其他的放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子。可以通过基于本文披露的 已知启动子序列，对合成寡核苷酸标记来制造用于杂交的探针。另外，可以使用依据核苷 酸序列中的保守性核苷酸而设计的简并引物。探针典型地包括核苷酸序列区域，该核苷 酸序列区域在严格条件下与本发明启动子序列的至少大约12、至少大约25、至少大约50、 75、100、125、150、175、200、250、300、350或400个连续核苷酸或其片段或变体杂交。杂交 探针的制备是本领域普遍已知的，且披露在上文萨姆布鲁克和拉塞尔，2001(Sambrookand Russell, 2001)中，其通过引用结合在此。
[0038]例如，本文所披露的完整启动子序列，或其一个或多个部分，可以被用作能够特异 地与类似启动子的相应序列杂交的探针。为了实现在多种条件下的特异性杂交，这些探针 包含唯一的、且至少约10个核苷酸长或至少约20个核苷酸长的序列。这些探针可以用于通 过PCR扩增来自选定生物体的对应启动子序列。该技术可以用于从目的生物体分离附加的 编码序列，或