者作为确定生物体中是否存在编码序列的诊断性试验。杂交技术包括平板脱 氧核糖核酸库（斑片或菌落）的杂交筛选（参见例如，萨姆布鲁克等人（1989)分子克隆： 实验手册（第二版，纽约冷泉港冷泉港实验室出版社）（Sambrooketal. (1989)Molecular Cloning:ALaboratoryManual(2ded. ,ColdSpringHarborLaboratoryPress,Cold SpringHarbor,NY))中。
[0039] 可以在严格条件下进行这些序列的杂交。"严格条件"或"严格杂交条件"意指这 样的条件，在该条件下探针将会与其靶序列杂交，其可检测程度高于与其它序列杂交的可 检测程度（例如，至少高于【背景技术】两倍）。严格条件是依赖序列的，并且在不同的环境中 会不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以鉴别出与探针100%互补的靶序列 (同源探测）。作为替代方案，严格条件可调整以允许序列中的一些错配，使得检测出更低 的相似度（异源探测）。通常，探针长度小于大约1000个核苷酸，或者长度小于500个核苷 酸。
[0040] 典型地，严格条件将是以下条件，其中盐浓度在pH为7. 0到8. 3时为低于约I. 5M Na离子，通常为大约0.01到I.OM钠离子浓度（或其他盐）并且短探针（例如，10到50个 核苷酸）的温度为至少约30摄氏度且长探针（例如，大于50个核苷酸）的温度为至少约 60摄氏度。也可以通过添加去稳定剂如甲酰胺实现严格性条件。示例性低严格条件包括 用30% -35%甲酰胺的缓冲溶液、IMNaClU%SDS(十二烷基硫酸钠）于37摄氏度杂交， 以及在IX至2XSSC(20XSSC= 3.OMNaCl/0. 3M柠檬酸三钠）中于50至55摄氏度冲洗； 示例性中等严格条件包括在40% -45%甲酰胺、I.OMNaCl、1 %SDS中于37摄氏度杂交，以 及在0. 5X至IXSSC中于55至60摄氏度冲洗；示例性高严格条件包括在50%甲酰胺、IM NaCl、1 %SDS中于37摄氏度杂交，以及在0.IXSSC中于60至65摄氏度冲洗。任选地，冲 洗缓冲剂可以包括大约〇. 1 %至大约1%SDS。通常杂交持续时间小于约24小时，通常约4 至约12小时。任选地，冲洗缓冲剂可以包括大约0. 1 %至大约1%SDS。
[0041] 特异性典型地是指杂交后冲洗的功能，关键因素是最终冲洗解决方案的离 子强度和温度。对于DNA-DNA杂交，Tni可以从梅尼克斯和沃尔（1984)分析生物化学 138:267-284(MeinkothandWahl(1984)Anal.Biochem. 138:267-284)的等式大致估算：Tn =81. 5摄氏度+16. 6(logM) +0. 41 (GC百分比）-0. 61 (百分比形式）-500/L;式中，M是单 价阳离子的摩尔浓度，GC百分比是DNA中的鸟甙和胞嘧啶核苷酸的百分率，百分比形式是 甲酰胺在杂交溶液中的百分率，并且L是碱基对中的杂交的长度。Tni是温度（在确定的离 子强度和PH下），在此温度下，50%的互补靶序列与完全相配的探针杂交。每错配1%，Tni 降低约1摄氏度；因而，可调整Tni、杂交和/或冲洗条件至与预期同一性的序列杂交。例如， 如果获得同一性大于或等于90%的序列，Tni可以降低10摄氏度。通常，严格条件被选择为 比在确定的离子强度和PH下的特异序列及其补足物的热力学熔点（Tni)低大约5摄氏度。 然而，高度严格条件可以在比热力学熔点（Tni)低1、2、3或4摄氏度下采用杂交和/或洗涤； 中等严格条件可以在比热力学熔点（Tni)低6、7、8、9或10摄氏度下采用杂交和/或洗涤； 低严格条件可以在比热力学熔点（Tni)低11、12、13、14、15或20摄氏度下采用杂交和/或 洗涤。使用等式、杂交、洗涤组合物以及预期的Tni，普通专业技术人员将会理解，杂交和/或 洗涤液条件严格性的变化属本质性描述。如果预期的错配度导致Tni少于45摄氏度（水溶 液）或32摄氏度（甲酰胺溶液），SSC浓度可以增加，以便可以使用较高温度。核酸杂交的 广泛指南可见于迪杰森（1993)生物化学和分子生物学实验技术一核酸探针杂交第2章第 1 部分（纽约愛思唯尔出版社）（Tijssen(1993)LaboratoryTechniquesinBiochemistry andMolecularBiology-HybridizationwithNucleicAcidProbes,PartI,Chapter 2 (Elsevier，NewYork));以及奥苏贝尔等人编（1995)现代分子生物学技术，第2章（纽 约格林出版社与威立交叉科学出版社）（Ausubeletal.，eds. (1995)CurrentProtocols inMolecularBiology,Chapter2(GreenePublishingandffiley-Interscience,New York)。参见萨姆布鲁克等人（1989)分子克隆：实验手册（第二版，纽约冷泉港冷泉港 实验室出版社）（Sambrooketal. (I989)MolecularCloning:ALaboratoryManual(2d ed. ,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY))〇
[0042]本发明包括具有启动子活性且在严格条件下与本文所披露的启动子序列或其片 段杂交的分离序列。
[0043]伸用方法
[0044]本发明的方法针对在本发明的启动子序列控制下在植物和植物细胞中表达异源 核苷序列。转基因植物可以在表型上发生变化，包括但不限于病原体或昆虫防卫机制的 改变，对一种或多种除草剂抗性增强，对胁迫环境条件的耐受能力增强，生产淀粉的能力提 尚，淀粉生广的水平提尚，油含量和/或组分提尚，利用、分隔和/或储存氣的能力提尚，等 等。这些结果可以通过异源基因的表达实现或通过在植物中的内源产物的增加的表达实 现。作为替代方案，结果可以通过减少一种或多种内源产物的表达，特别是酶类、转运体，或 辅因子实现，或影响在植物中的养分摄取来实现。
[0045]通常，本发明启动子的核苷酸序列设置在表达盒中，其具有目的核苷酸序列，典型 地异源核苷酸序列，用于在目的植物中的表达。"异源核苷酸序列"是指非自然地可操作地 连接至启动子序列的序列，包括自然存在的脱氧核糖核酸序列的非自然存在的多个拷贝。 虽然此核苷酸序列对启动子序列是异源的，但对植物宿主可以是同源的、或天然的或异源 的或外来的。应该认识到，启动子也可以驱动其相应的同源或天然核苷酸序列的表达。在 某些情况下，转化植物可以在表型上发生变化。异源核酸序列包括外源的，或不存在于未转 化植物细胞中的序列，也可以是内源的，或存在于未转化植物细胞中的序列。"异源"通常是 指如下核酸序列，其对于所在细胞或天然基因组的一部分不是内源的，且已经通过感染、转 染、显微注射、电穿孔、显微映像等添加到细胞中。
[0046]任何目的序列可以由本发明的启动子序列表达。这些异源核苷酸序列包括但不限 于抗除草剂编码序列、杀虫剂编码序列、杀线虫编码序列、抗菌编码序列、抗真菌编码序列、 抗病毒编码序列，非生物和生物胁迫耐受编码序列，或修改植物特征（例如产量、粮食品 质、营养成分、淀粉品质和量、固氮和/或氮利用，含油量和/或成分）的序列。
[0047]本发明的更多特异性目的基因包括但不限于提高农作物产量的基因，提高作物必 要性的基因，对赋予非生物胁迫（例如干旱、温度、盐浓度、有毒金属物或微量元素）耐受性 的蛋白质进行编码的基因，或对毒素（例如杀有害生物剂和除草剂）产生抗性的基因，或对 生物胁迫（例如真菌、病毒、细菌、昆虫，以及线虫的攻击）产生抗性的基因，以及对这些生 物体有关病害的发展产生抗性的基因。认识到任何目的基因可以与本发明的启动子序列可 操作地连接并在植物中表达。
[0048]这些异源核苷酸序列可以编码涉及提供抗病性或有害生物抗性的蛋白质。"抗病 性"或"有害生物抗性"是指使植物避免植物病原体相互作用产生的有害症状。抗病性和 抗虫性基因，例如用于抗菌保护的溶菌酶或杀菌肽，或蛋白质，例如用于抗真菌保护的葡聚 糖酶或者壳多糖酶，或苏云金杆菌内毒素、蛋白酶抑制剂、胶原酶、外源凝集素，或用于控制 线虫或昆虫的糖苷酶，均是有用基因产物的例子。目的基因的例子例如可以在WWW.nbiap. vt.edu/cfdocs/fieldtests2.cfm找到。
[0049]"有害生物"包括但不限于昆虫、真菌、细菌、病毒、线虫、螨虫、蜱等等。昆虫有害生 物包括选自以下目的昆虫：鞘翅目、双翅目、膜翅目、鳞翅类、食毛目、同翅目、半翅目、直翅 目、总翅类、革翅目、等翅目、虱属、蚤目、毛翅目等，特别地是鞘翅目、鳞翅类，以及双翅目。 病毒包括但不仅限于烟草或黄瓜花叶病毒、环斑病毒、坏死病毒、玉米矮花叶病毒等等。线 虫包括但不仅限于寄生线虫，例如根癌、囊肿，以及病变线虫，其包括异皮虫，根结线虫，以 及球异皮线虫；特别地，囊线虫的成员，包括但不限于胞囊线虫（大豆胞囊线虫）；甜菜异皮 线虫（甜菜胞囊线虫）；禾谷异皮线虫（禾谷胞囊线虫）；以及马铃薯金线虫和马铃薯白线 虫（马铃薯胞囊线虫）。病变线虫包括但不仅限于短体线虫。真菌有害生物包括引起叶锈 病、黄锈病、条锈病以及茎锈病的真菌有害生物。
[0050] "抗除草剂蛋白"源自"抗除草剂编码核酸分子"的蛋白包括，与不表达该蛋白的细 胞相比，赋予细胞耐受更高浓度的除草剂的蛋白，或与不表达该蛋白的细胞相比，耐受一定 浓度的除草剂时间更长的蛋白。除草剂抗性性状通过基因编码可以被引入植物，基因编码 用于获得对除草剂抗性，这种除草剂可抑制乙酰乳酸合酶（ALS)的作用，特别地磺酰脲类 除草剂，可以抑制谷氨酰胺的作用，例如膦苏菌素或basta(例如，bar基因）、草甘膦（例 如，EPSP合酶基因和GAT基因），或对本领域已知的其他类似基因编码。
[0051] 提高农作物产量的基因包括矮小基因，例如Rhtl和Rht2(彭等人（1999)自然 400:256-261)(Pengetal. (1999)Nature400:256-261)，以及加快植物生长的基因，例如 铵诱导的谷氨酸脱氢酶。提高作物必要性的基因包括，例如，允许植物减少饱合脂肪含量的 基因、提高植物的营养价值的基因、增加籽粒蛋白的基因。提高耐盐性的基因是增加或允许 植物在比植物的天然环境更高盐浓度的环境中生长的基因，在这些基因中引入耐盐基因。
[0052] 还提供了用于识别调控元件（例如，启动子、终止子以及增强子）的方法。"调控 元件"或"调控区"是指基因上游或下游发现的核酸的一部分，该核酸的一部分可以由DNA 或RNA组成，或都包括DNA和RNA以及参与基因表达的物质。调控元件可以能够调解器官 特异性，或控制发展基因激活或暂时基因激活，并包括启动子元件、核心启动子元件，可诱 导以响应外刺激的元件、构建体激活的元件、转录终止子、多腺苷酸化信号，减小或增大启 动子活性的元件，例如分别为负调控元件或转录增强子。"顺式作用"是指物理上与转录序 列连续的序列。顺式作用序列典型地