与蛋白质或其他分子相互作用以执行（开/关、调控、 调整等等）转录。"转录增强子"是指如下核酸序列，当该核酸序列靠近启动子并存在于能 够支持转录的转录介质中，与在没有增强子的情况下启动子产生的相比，其赋予更多的转 录活性。增强子可以在基因的上游、内里，或下游，甚至距离转录起始位点长达50千碱基产 生作用。增强子也可独立地产生作用，与其方向无关。"转录终止子"是指脱氧核糖核酸序 列，该序列包括减少或消除转录所必要的核苷酸碱基对序列。"多腺苷酸化信号"是指控制 转录和翻译终止的序列。
[0053] 通过基于植物基因或调控元件设计一种或多种PCR引物，用于植物中使用的调控 顺序可以从大豆中克隆。该方法可以包括设计能够与植物的核苷酸序列杂交的至少一种引 物，使用引物扩增来自大豆植物的DNA以产生扩增DNA，以及测试用于调控序列活性的扩增 DNA。"调控序列活动"是指实现基因转录或翻译的能力。它包括启动子活性、转录增强子活 性、终止转录活性，以及聚腺苷酸化活性。测量或测试启动子活性的方法是本领域中公知的 (参见题为"启动子活性评估"的部分）。测量或测试增强子活性的方法是本领域中公知的 (参见例如，美国专利号6, 806, 064、6, 818, 757以及6, 784, 289)。测量或测试终止子活性 的方法是本领域中公知的（参见例如，美国专利号5, 093, 252)。测量或测试多聚腺苷酸活 性的方法是本领域中公知的（参见例如，美国专利号6, 632, 637)。
[0054] 作为替代方案，调控元件可以通过其他方法被识别并克隆。例如，大豆基因组或次 基因组文库能够使用BAC、粘端质粒或A载体构建。可通过使用植物中的启动子元件来探 测库。作为替代方案，可以通过使用来自植物的基因编码区域来探测文库。由此产生的克 隆能够被测序，并确定围绕大豆编码区域的顺式作用元件。作为替代方案，来自不同大豆基 因的编码区域的片段可通过PCR从基因组DNA进行扩增，使用从植物基因的保守区设计的 引物，例如玉米的保守区。如前所述，随后大豆编码区片段能够用于探测基因组文库。
[0055] 可使用反向PCR克隆顺式作用元件。如上所述，可获得大豆基因编码区的序列，然 后使用设计的PCR引物和反向PCR，以本领域所公知的技术克隆编码区两侧的DNA。
[0056] 反义的
[0057] 可操作地连接到本文所披露的大豆启动子的异源核苷酸序列可以是用于靶基因 的反义核苷酸序列。"反义核苷酸序列"是指处于与该核苷酸序列的5'-至-3'正常方向相 反的方向的序列。反义DNA序列在植物细胞中的表达防止了靶基因的正常表达。反义核苷 酸序列编码RNA转录物，该RNA转录物与由靶基因转录产生的内源性信使RNA(mRNA)互补 且能够杂交到该内源性信使RNA(mRNA)。以这种方式，抑制通过靶基因编码的天然蛋白的产 生，并实现预期的表型反应。只要序列杂交至相应mRNA并干扰其表达，反义序列的修饰就 可以被实现。可使用与相应反义序列具有大约70 %、80 %、85 %、90 %或95 %序列同一性的 反义构建体。此外，可使用一部分反义核苷酸中断靶基因的表达。通常，可使用至少50个 连续核苷酸、100个连续核苷酸、200个连续核苷酸或更多核苷酸的序列。因而，本文所披露 的启动子序列可以可操作地连接到反义DNA序列，以减少或抑制在植物中的天然蛋白的表 达。
[0058] 棺物表汰倉和转化载体
[0059] 植物细胞的转化可以通过本领域内已知的多种技术之一实现。"植物"指整个植 物、植物器官（例如，叶、茎、根等）、种子、植物细胞、无性繁殖体、胚及其后代。植物细胞可 以是分化的或未分化的（例如愈伤组织、悬浮培养细胞、原生质体、叶细胞、根细胞、韧皮部 细胞、花粉）。"转基因植物"或"转化植物"或"稳定转化的"植物或细胞或组织是指已经将 外源核酸序列或DNA片段结合到或整合到植物细胞中的植物。"稳定转化的"意指引入植物 的核苷酸构建体整合到植物的基因组，并能够由后代继承。
[0060] 本发明的启动子序列可在表达盒中提供，表达盒使其能够驱动植物细胞中的目的 异源序列的表达。"表达盒"意指能够引起来自细胞中的开放阅读框的蛋白质表达的DNA构 建体。盒将沿5'-3'的转录方向，包括转录起始区，以及在植物中起作用的翻译和转录终 止区（即终端区），该转录起始区包括本文所披露的启动子核苷酸序列之一，或其变体或片 段，其可操作地连接至目的异源序列。此外，盒可以含有至少一个附加基因以被共转化为生 物体，例如可选择的标记基因。作为替代方案，附加基因可以设置于多表达盒上。这样的表 达盒设有多个限制位点，用于在调控区的转录调控作用下插入目的异源序列。
[0061] 这些构建体通常还含有5'和3'端非翻译区。这些构建体可以含有被翻译的"信 号序列"或"前导序列"，以促进目的肽向某些细胞内结构的共翻译或翻译后转运，或促使其 分泌，这些结构为例如叶绿体（或其它质体）、内质网或高尔基体。例如，基因可利用工程 方法加工使其含有信号肽，以促进肽向内质网的转移。还可以优选地加工植物表达盒，使之 含有内含子，从而其表达需要内含子的mRNA加工。"信号序列"是指已知的或可能导致穿过 细胞膜的共翻译或翻译后肽转运的序列。在真核细胞中，其典型地涉及向高尔基体中的分 泌，有些会导致糖基化。"前导序列"是指在翻译时产生足以触发肽链向亚细胞细胞器共翻 译转运的氨基酸序列的序列。因而，其包括通过进入内质网、液泡通道、包括叶绿体、线粒体 等质体而靶向转运和/或糖基化的前导序列。
[0062] "3'非翻译区"是指位于编码序列下游的核苷酸序列。多腺苷酸化信号序列，以及 编码能够影响将多腺苷酸片段添加到mRNA前体3'端的调控信号的其他序列，都是3'非翻 译区。"5'非翻译区"是指位于编码序列上游的核苷酸序列。其他上游或下游的非翻译元 件包括增强子。增强子是作用是提高启动子区的表达的核苷酸序列。增强子是本领域中公 知的，且包括但不限于SV40增强子区和35S增强子元件。
[0063] 终止区域可以是与包括本发明启动子核苷酸序列的转录起始区原生的，可以是与 目的DNA序列原生的，或可以来自另一来源。合适的终止区可以从根癌农杆菌的Ti-质粒 得到，例如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶终止区。参见格里诺等人（1991)分子遗传学与普通 遗传学 262:141-144(Guerineauetal.(1991)Mol.Gen.Genet. 262:141-144);普劳德富 特（1991)细胞 64:671-674(Proudfoot(1991)Cell64:671-674);桑斯法冈等人（1991)基 因发育 5:00141-149(Sanfaconetal. (1991)GenesDev. 5:141-149);莫根等人（1990)植 物细胞 2:1261-1272(Mogenetal.(1990)PlantCell2:1261-1272);芒罗等人（1990) 基因 91:151-158(Munroeetal. (1990)Gene91:151-158);巴拉斯等人（1989)核酸研究 17:7891-7903(Ballasetal.(1989)NucleicAcidsRes. 17:7891-7903);以及乔希等人 (1987)核酸研究 15:9627-9639(Joshietal. (1987)NucleicAcidRes. 15:9627-9639)。 [0064] 在适当情况下，可优化目的基因以增加在转化宿主细胞中的表达。也就是说，可 以使用宿主细胞优选的密码子合成基因以改进表达，或者可以根据宿主优选的密码子使用 频率用密码子合成基因。通常，基因的GC含量将增加。参见例如，卡贝尔和格里（1990) 植物生理学 92:1-11(CampbellandGowri(1990)PlantPhysiol. 92:1-11)，用于讨论宿 主优选的密码子使用。用于合成植物优选基因的方法是本领域已知的。参见例如，美国 专利号 6, 320, 100、6, 075, 185、5, 380, 831 以及 5, 436, 391 ;美国公布申请号 20040005600 和No. 20010003849;以及默里等人（1989)核酸研究 17:477-498(Murrayetal. (1989) NucleicAcidsRes. 17:477-498)，这些通过引用结合在此。
[0065] 在一个实施例中，将目的核酸靶向定位在叶绿体中进行表达。以此方式，当 目的核酸不是直接插入到叶绿体中时，表达盒将额外含有编码转运肽的核酸或将目的 基因产物引导至叶绿体的信号序列。这些转运肽是本领域已知的。参见例如，冯海耶 等人（1991)植物分子生物学导报 9:104-126(VonHeijneetal.(1991)PlantMol. Biol.R印.9:104-126);克拉克等人（1989)生物化学杂志 264:17544-17550(Clarket al. (1989)J.Biol.Chem. 264:17544-17550);黛拉-塞奥帕等人（1987)植物生理学 84:965-968(Della-Cioppaetal. (1987)PlantPhysiol. 84:965-968);罗默等人（1993) 生物化学与生物物理学研究通讯 196:1414-1421(Romeretal. (1993)Biochem.Biophys. Res.Commun. 196:1414-1421);沙阿等人（1986)科学 233:478-481(Shahetal. (1986) Science233:478-481)。
[0066] 可以优化要靶向定位至叶绿体的目的核酸，以在叶绿体中表达，说明在植物核和 该细胞器之间的密码子使用差异。以此方式，可以使用叶绿体偏好的密码子合成目的核酸。 参见例如，美国专利号5, 380, 831，其通过引用结合在此。
[0067] "植物表达盒"典型地将被插入到"植物转化载体"。"转化载体"是指对于有效 转化植物细胞必需的DNA分子。这样的分子可以包括一个或多个植物表达盒，且可以 组织成一个以上"载体"DNA分子。例如，二元载体是使用2个非连续DNA载体编码转 化植物细胞的所有必需的顺式和反式作用功能的植物转化载体（海伦斯和姆林内克斯 (2000)植物科学发展趋势，5:446-451)(HellensandMullineaux(2000)TrendsinPlant Science, 5:446-451)。"载体"是指设计成在不同的宿主细胞之间进行转移的核酸构建体。 "表达载体"是指能在外来细胞中结合、整合和表达异源DNA序列或片段的载体。"引入"是 指将核苷酸构建体提供给正在被转化的生物体，其方式为使得构建体能够到达生物体的至 少一个细胞的内部。
[0068]此植物转化载体可以包括实现植物转化所需要的一种或多种DNA载体。例如，本 领域的通常作法是使用包括一个以上的连续DNA片段的植物转化载体。这些载体在本领域 通常称为'二元载体'。二元载体以及带有辅助质粒的载体最常用于农杆菌介导转化，在这 种转化中，实现有效转化所需的DNA片