进行统计分析以测定可检测标签所发射的信 号强度的平均值或中值（或任何其他统计量，如峰值、修剪均数、修剪峰值等）。阳性珠子 亚组的比例优选地通过筛选分析中所用的不同的探针数和不同的标记珠子数来确定。阳性 珠子是发射的信号大于所选阈值的那些，其中所述阈值代表样品DNA中存在一种或多种组 织分型抗原等位基因。用于分析使用流式细胞术的信号的示例性软件得自Luminex，Inc. (Austin，TX)和BDBiosciences(SanJose，CA)。其他软件的实例包括WinMDI(Windows MultipleDocumentInterfaceforFlowCytometry)、FCSExpress(DeNovoSoftware, Thornhill，ONCanada)、FlowJ0(TreeStar，Inc.)。阳性珠子亚组将表明样品DNA或生物 样品中可能存在的组织分型抗原的数目。可以使用本领域内的标准分析可检测标签强度的 软件来分析数据。
[0047] 检测阳性珠子（在过滤步骤之后）的所选阈值对于任何单独的探针都是相同的。 所选阈值通常通过分析已知的阳性样品组和已知的阴性样品组并鉴别两者之间的差异来 确定。然后在该差异内设定阈值。
[0048] 本发明提供利用在珠子上具有相同可鉴别特征的多种探针来进行基于DNA的组 织分型或基于蛋白的组织分型的改良方法。使用固定在珠子上的一个亚组的具有相同可 鉴别特征的多种探针使得能够检测来自阳性珠子的更强的信号，因为仅检测一个特征或信 号。此外，使用本发明的改良方法检测的信号接近由特异性结合相互作用（如DNA/SS0杂 交或抗体/抗原结合）产生的实际信号强度的真实值。信号强度的真实值是使用常规方法 测量的值，该常规方法使用各自具有不同可鉴别特征的珠子，这些珠子各自具有不同的荧 光标记和独特的SS0探针或肽探针。因此使用改良的方法检测的信号与使用常规方法检测 的信号类似。
[0049] 这种基于DNA的组织分型或基于蛋白的组织分型的改良方法的一个优点是初步 组织分型筛选提供很多关于样品DNA或生物样品中不存在的组织分型抗原的信息。然而， 由于体系固有的模糊性，关于样品DNA或生物样品中一定存在的抗原的信息可能稍欠精 确。降低系统模糊性的方法在下文描述。这种方法不太昂贵，因为其涉及了较少的不同的 可鉴别珠子，并且明显缩小了样品DNA或生物样品中的可能的阳性抗原总数。而且，该方法 降低了人力成本，因为需要较少的测试循环。此外，该方法由于可以使用较多数目的探针的 同时使用较少数量的珠子而使得能够测试更多数目的组织分型抗原基因序列。此外，该改 良的方法使得能够在较短的时间内具有较高的分型分辨率，由于组织要尽快移植，因而这 是有利的。
[0050] 分析在一组具有相同可鉴别特征的微粒中的多个微粒亚组会导致假阴性数目增 加。具体地，如果DNA样品仅与一组中的少量微粒（如一个微粒亚组）杂交，则杂交产生 的信号强度将会很低，可能被认为是阴性事件，即假阴性事件。为解决假阴性问题，选择一 个产生阳性信号的所选比例用于进一步评定。这个所选比例将小于所有（100%)的阳性 组。优选地，阳性组的所选比例小于90 %、小于80 %、小于70 %、小于60 %、小于50 %、小 于40%、小于30%、小于20%或小于10%的阳性微粒组。所选择的比例可以依据组织分型 筛选中所用的SS0探针数和总微粒数而定。此外，该比例可以通过检测信号的减少来选择， 即，分析曲线的斜率。
[0051] 其中相同标记的蛋白能够与多种不同靶标结合的体系的固有模糊性可以通过在 不同的微粒组和亚组中探针的适当排列来降低。微粒上SS0或基于蛋白的探针的选择使得 能够检测特定的等位基因或特定的抗原。例如可以将一组内的SS0类型或不同组之间的类 型设计成容许选择性地消除某些等位基因或选择少数等位基因。这些探针类型可以在一组 微粒中具有多拷贝的相同探针或者在不同组微粒中具有多拷贝的相同探针。相同探针的数 目和不同探针比率的变化使得能够通过较少的分析产生额外的数据。
[0052] 本发明具体提供在一组微粒中的探针亚组，其中一组的所述微粒具有相同的可鉴 别特征，并且探针数目在不同亚组之间不同。亚组之间的探针比率使得能够进行生物样品 内靶分子（如HLA等位基因）存在的复杂分析。单个微粒组内亚组之间探针比率的变化使 得能够选择较大比例的阳性事件用于进一步的统计分析，或换句话讲，在过滤步骤中将选 择较大比例的事件，而降低假阴性事件的可能。
[0053] 在另一实施方式中，单个组内亚组之间探针比率的变化可以降低体系内的模糊 性，这通过容许根据产生某些信号的微粒的百分比鉴别靶分子来达成。
[0054] 计算机算法的使用将容许阳性探针类型分析或探针比率变化分析以测定特定组 织分型或测定罕见等位基因的存在对常见等位基因的存在。更有效的是使用SS0类型或具 有相同可鉴别特征的一组微粒的亚组之间不同比例的SS0,而不是使用各自含有不同SS0 和不同可鉴别特征的一组100种微粒来进行复杂分析。
[0055] 本发明的优选实施方式使用呈现用于基于DNA的组织分型的SS0的微粒。然而，本 发明还提供使用呈现用于检测生物样品中的抗体的组织分型抗原的微粒的组织分型方法。 改良的发明关于基于DNA的组织分型的优点对于基于蛋白的分析（抗原/抗体反应）也是 有利的。例如，珠子亚组可以用HLA*A*0201抗原、HLA*A*0202抗原和/或HLA* A*0203抗原标记以检测生物样品中结合这些抗原的抗体的存在。
[0056] 本发明的方法可以用任何材料的微粒、微珠、珠子或微球进行，所述材料如：二 氧化硅、金、乳胶、聚合物，如聚苯乙烯、聚砜和聚乙基或水凝胶。其他的示例性微粒用 染料编码，将寡核苷酸固定在编码的微粒上。用于本发明方法的微粒购自诸如Luminex Inc.，Invitrogen(Carlsbad，CA)、PolysciencesInc. (Warrington,PA)和Bangs Laboratories(Fishers，IN)等来源。
[0057] 本发明的微粒可以包含可检测标签或其他的鉴别特征。所述微粒可包含单种荧 光染料或多种荧光染料。在一个实施方式中，所述微粒用荧光染料进行内部标记并且含有 与生物分子共价连接的表面羧基基团。在另一个实施方式中，所述微粒用荧光染料进行内 部标记并且含有亲和素表面层以便接近生物素和生物素化配体的共价结合。在另一个实施 方式中，所述微粒可以包含不同染料的组合，如荧光和非荧光染料。例如所述微粒可以用 E)-5-[2-(甲氧基羰基）乙烯基]胞苷标记，其为一种非荧光分子，在经受紫外线（UV)照射 时产生单一产物3-0-D-呋核亚硝脲-2, 7-二氧代吡啶并[2, 3-d]嘧啶，显示强的荧光信 号。在另一个实施方式中，所述微粒可以包含条形码作为可鉴别特征，如美国专利公布US 20070037195 中所述。
[0058] 在另一个实施方式中，所述微粒可以是纳米晶体或量子点。这些纳米晶体是 吸收光的光子，然后重新发射不同波长的光子（荧光团）的物质。此外，可以将另外的 焚光标签或第二抗体结合至纳米晶体。这些纳米晶体购自诸如Invitrogen和Evident Technologies(Troy，NY)等来源。
[0059] 微粒的可鉴别特征可以是任何纳米粒子基于DNA的检测方法或任何纳米粒子基 于蛋白的检测方法。一个实例是生物条形码，这是一种使用由DNA编码的纳米粒子探针 检测蛋白的超敏感方法，所述DNA对生物样品中的蛋白革巴标是独特的（Nam等人，Science 301，1884-1886,2003)。纳米粒子基于DNA的检测的实例包括基于巯基烷基寡核苷酸改 性的金纳米粒子的比色多核苷酸检测方法（Elghanian等人，Science277,1078-1080， 1997)、依赖于光散射或银染的芯片基检测方法（Taton等人Science289,1757-1760， 2000;Taton等人，?J.Am.Chem.Soc.，123, 5164-5165, 2001)、用于DNA的电检测方法，其中 使用夹心分析将靶DNA捕获在两个电极的间隙中（Park等人，Science295,1503-1506， 2002)和使用同时在多个激光波长询问的化学反应性衍射栅进行的DNA检测（Cao等人， J.Am.Chem.Soc. 2003) 〇
[0060] 本发明可以用检测可鉴别特征或标签的任何体系来进行，如FLOW。荧光 标签的检测也可以使用能读出微粒上图像的显微镜或照相机来进行，如Bioarray BeadChip(BioarraySolutions，Ltd.，Warren，NJ)。BeadChip形式结合了微粒（"珠子"） 化学与半导体晶片工艺，其中使用光学显微镜和照相机记录与微粒的结合。
[0061] 本发明方法中所用的样品DNA由人移植或输血的供体或人移植或输血的受 体的生物样品分离或提取。所述样品DNA可以使用本领域内的任何常规方法制备， 如Sambrook等人，MolecularCloning：ALaboratoryManual，coldSpringsHarbor Laboratories(NewYork，1989)中所教导的那些。所关注的组织分型基因（如HLA)使用本 领域内标准的PCR技术扩增。
[0062] 生物样品包括全血、血液衍生物、红细胞浓缩物、血浆、血清、新鲜的冷冻血浆、全 血衍生的血小板浓缩物、机采血小板、混合血小板、静脉内y-球蛋白、冷沉淀物、脑脊液、 组织和细胞，如上皮细胞（如自口腔收集的那些）、干细胞、白细胞、中性粒细胞和粒细胞。 所述生物样品可以自要用于移植的组织或细胞的人供体或要用于输血的血液或血液衍生 物的人供体获得。所述生物样品可以自健康的骨髓供体或亲子测试的受试者获得。所述生 物样品还可以自是预期的移植或输血受体的人受试者或捐献要用于移植或输血的组织或 器官的人受试者获得。或者，所述生物样品可以从要用于在人受体中移植的组织或细胞直 接获得。此外，所述生物样品可以自要用于在人受体中输血的血液或血液衍生物获得。
[0063] SS0 探针
[0064] 为了实施本发明的方法，将SSO探针结合至荧光标记的珠子。所述SSO探针还 可以含有标签，如生物素，链霉亲和素、镍、六聚组氨酸、地高辛（DIG)、DNP，或荧光标签，如 FITC、PE、6-TAMRA、CR6G、DEAC、德克萨斯红（TexasRed)、Cy3、Cy3. 5、CY5、Cy5. 5、Cy7、罗 丹明绿（RhodamineGreen)X。如本文所用的术语"核苷酸"是指存在于DNA或RNA中的核 苷酸，因此包括含有作为碱基的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶、以及作为脱氧 核糖或核糖的糖部分的核苷酸。然而，应了解，本发明所采用的诊断探针中可以使用能够与 常规碱基腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和鸟嘧啶之一进行碱基配对的其他经修饰的碱 基。此类经修饰的碱基包括：例如，8-氮杂鸟嘌呤和次黄嘌呤。如本文所用的术语"寡核苷 酸"是指为200个核苷酸或更少的分子，优选的寡核苷酸为100个核苷酸或更少、50个核苷 酸或更少或25个核苷酸或更少。
[0065] 本文在涉及核苷酸时所用的术语"互补"是指核苷酸与另一特定核苷酸碱基配对。 因此腺苷一磷酸与尿苷一磷酸或胸苷一磷酸互补，鸟苷一磷酸与胞苷一磷酸互补。应了解 尽管胸苷一磷酸与鸟苷一磷酸在某些情况下可能碱基配对，但它们用于本说明书的目的时 不认为是互补的。也应了解