确定的抗原（HNA-2a)。HNA-2仅在中性 粒细胞和中性粒细胞前体上表达，其位于糖蛋白⑶177 (NBlgp)上。HNA-3具有一个抗原 HNA-3a，也称为5b。HNA-3在中性粒细胞、淋巴细胞、血小板、内皮细胞、肾、脾和胎盘细胞上 表达，已知它位于70至95kD中性粒细胞糖蛋白上。HNA-4和HNA-5位于0 2整联蛋白上。 HNA-4在粒细胞、单核细胞和淋巴细胞上表达。（参见Stroncek，ASHIQuarterly2004)。
[0088] T细朐夸体
[0089] 主要组织相容性复合体（MHC)细胞表面糖蛋白呈递的抗原肽由T细胞通过T细胞 受体（TCR)复合体识别，T细胞受体复合体是由T细胞受体和CD3链构成的多亚基跨膜表 面复合体。TCR直接结合肽/MHC复合体，并通过与⑶3和TCR的其他组分的相互作用激活 T细胞。因此，TCR参与了自我和外来组织识别，并分析组织的TCR表达，该表达可能有助于 组织分型移植供体和受体。
[0090] 试剂盒
[0091] 本发明还提供实施本发明方法的试剂盒。具体来说，本发明提供用于实施基于DNA 的组织分型方法的试剂盒，该试剂盒包括：a)具有可鉴别特征的多组微粒，其中在各组中， 每个微粒具有相同的鉴别特征；和b)SS0探针，其中不同SS0探针固定在一组内的微粒上。
[0092] 本发明的其他方面和优点将通过参考下列示例性实施例来理解。
[0093] 实施例1
[0094] 常规方法与本发明方法的比较
[0095] 珠子、探针和样品DNA制备
[0096]使用L.AJB.TVPE?.SSODRB1Locus(OneLambdaInc.，CanogaPark，CA)进行 下述DNA组织分型分析。LuminexXMAP微球（Austin，TX)具有两种荧光染料包埋在其中。 使用具有不同浓度的各种包埋荧光染料的各种微球（或珠子）。
[0097] 用胺标记SS0探针，将其结合到珠子上。HLADRB1外显子2由使用生物素化引物 的PCR从分离自生物或组织样品的DNA扩增。在5'端用生物素标记所得PCR产物（本文 称为"样品DNA")。使样品DNA接触珠子，样品DNA与固定于珠子上的SS0探针的杂交在用 结合有荧光染料藻红蛋白（PE)的链霉亲和素孵育后产生代表样品DNA和SS0探针杂交的 荧光信号。用流式细胞术检测并测量该荧光信号。（DNA可以来自任何来源，优选血液或颊 试子）。
[0098] 在样品DNA内扩增的HLA基因和固定于微粒上的SS0探针之间的DNA杂交反应如 下进行。使用预优化的热循环程序设定标准基因扩增反应物，该扩增反应物包含：约lng/y1基因组DNA和10微摩尔相应的序列特异性生物素化引物。将5微升的含有扩增的DRB1 * 0814的所得混合物变性、中和并与结合所需探针的微粒（1000个微粒/探针/测试）在 1MNaCl和70mM磷酸钠缓冲液中混合。将杂交反应物在60°C下孵育15分钟。然后将2体 积的50nMNaCl溶液（在60°C预热）添加到混合物中，离心试管5分钟。在不打乱沉淀微 粒的情况下移除上清液。将此洗涤步骤重复多于两次。
[0099] 然后通过添加3体积的5微克/微升的藻红蛋白-链霉亲和素结合物标记杂交的 DNA。将标记混合物在60°C下孵育5分钟，如上所述洗涤。用50nMNaCl将洗涤的微粒重 悬至80微升体积。使用Luminex100流式分析仪激发、检测和记录注入仪器的各个微粒在 580nm处的荧光信号来检测杂交信号。每次测试分析约500个微粒用来分析计算各探针的 修剪均数荧光强度（MFI)。然后使用用于测试的各探针的所得MFI和来自适当阳性对照探 针的MFI来计算相对杂交信号。
[0100] 阳性对照探针是识别可以由特异性引物组扩增的所有等位基因的非多态性区域 的探针。用于本发明的靶核酸链包括已经使用聚合酶链式反应（PCR)扩增的等位基因区 域。使用阳性对照探针来提供参考信号以便可以估计扩增DNA(扩增子）量的变化。使用阳 性对照信号来计算所有诊断探针的相对信号，诊断探针信号表示为阳性对照信号百分比。
[0101] 常规分析
[0102] 对于常规基于DNA的组织分型方法，如上所述将100种不同荧光标记的珠子各自 与不同的HLA特异性探针结合。使珠子接触样品DNA。使用Luminex100流式分析仪测量 样品DNA与任何珠子的杂交。
[0103] 使用Luminex100流式分析仪软件统计分析流式细胞术数据。所关注珠子（珠子 37)的荧光强度的修剪均值为1707。修剪均值是当去除某一百分比的高和低例外值时计算 的平均值。
[0104] 伸用本发明方法的分析
[0105] 使用本发明的基于DNA的组织分型方法，将一些珠子37 (750种珠子）与表1中所 列的5种HLA特异性SS0探针中的一种结合。使珠子与样品DNA接触。使用Luminex100 流式分析仪测量样品DNA与任何珠子的杂交。由于测试了 5种探针，所以进一步分析20% 的阳性珠子。
[0106]表1
[0107]表1
[0108]
[0109] 使用Luminex100流式分析仪软件统计分析流式细胞术数据。这种分析包括测定 所分析珠子的大小、包埋在珠子中的各荧光染料的荧光强度、以及荧光强度是否在所需范 围内的测定。分析各染料的荧光强度以测定RPI。RPI代表样品DNA与珠子杂交所产生的 荧光强度。在此实施例中，RP1代表样品DNA上标记的PE的真实荧光强度。这个值表示样 品DNA已与结合到珠子37的SS0探针杂交。
[0110] 对于珠子37, 574个事件的RPI小于216,它们被认为是阴性，即样品DNA不与SS0 探针杂交。此外，有151个阳性事件（R0I> 5650)，阳性事件表示样品DNA与SS0探针杂 交。阳性与阴性事件的比率为151 : 574,其约为1 : 4。因此五分之一的探针对于样品 DNA是阳性的。阳性珠子的平均RPI为8152。这个值是较强的信号并且是大于用常规方法 计算的平均RPI(1707)的真实值的增强信号。
[0111] 已知此实验中所用的DNA样品仅对于DRB1 * 0814(与探针0LR4916杂交，参见表 1)为阳性的。仅20%的阳性事件的分析表明珠子37是阳性的，所检测的平均信号（8152) 强度与通过实施常规方法产生的强度类似（1个珠子/I种探针）。此实验证明了本发明方 法的选择步骤增强了阳性信号。此外，此实施例证明了可以使用相同或较少数目的珠子筛 选较多的靶标，并且所产生的信号与使用常规方法产生的信号类似。
[0112] 实施例2
[0113] 常规方法与本发明方法的另外比较
[0114] 用于HLA等位基因抗原的基于DNA的组织分型的常规方法与本发明改良方法的另 外比较如实施例1所述进行。这些方法中所用的样品DNA含有扩增的HLA抗原等位基因 DRB1 ★ 0416。
[0115] 使用实施例1中所述的Luminex100流式分析仪检测杂交信号。使用用于测试的 各探针的所得MFI和来自适当阳性对照探针的MFI来计算相对杂交信号。同样使用识别可 以由特异性引物组扩增的所有等位基因上的非多态性区域的阳性对照探针。
[0116] 常规方法
[0117] 对于常规基于DNA的组织分型方法，如上所述将100个不同荧光标记的珠子各自 与不同的HLA特异性SS0探针结合。使珠子与样品DNA接触。使用Luminex100流式分析 仪测量样品DNA与任一珠子的杂交。
[0118] 使用Luminex100流式分析仪软件统计分析流式细胞术数据。所关注珠子（珠子 73)的荧光强度的修剪均值为400。
[0119] 伸用本发明方法的分析
[0120] 使用本发明的基于DNA的组织分型方法，使一些珠子73 (838个珠子）与表2中所 列的5种HLA特异性SS0探针中的一种结合。使珠子与样品DNA接触。使用Luminex100 流式分析仪测量样品DNA与任一珠子的杂交。由于测试了 5种探针，所以进一步分析20% 的阳性珠子。
[0121] 表 2
[0122] 表 2
[0123] 珠子
[0124]
[0125] 如实施例1所述使用Luminex100流式分析仪软件统计分析流式细胞术数据。对 于珠子73, 672个事件的RPI小于48 (平均值=16)，它们被认为是阴性，即样品DNA不与 SS0探针杂交。此外，有166个阳性事件（R0I> 1457)，阳性事件表示样品DNA与SS0探针 杂交。阳性与阴性事件的比率为166 : 672,其约为1 : 4。因此五分之一的探针对于样品 DNA是阳性的。阳性珠子的平均RPI为2510。这个值是较强的信号并且是用常规方法计算 的平均RPI的更真实值（400)。
[0126] 已知此实验中所用的DNA样品仅对于DRB1 * 0416(与探针DR148杂交，参见表2) 为阳性的。仅20%的阳性事件的分析表明珠子73是阳性的，所检测的平均信号（2510)强 度与通过实施常规方法产生的强度类似（对于常规方法平均值为400)。此实验证实了实施 例1中所述的分析。
[0127] 本领域的那些技术人员参考本发明所列的优选实施方式可以预期本发明实施中 的多种修改和变化。因此，对本发明范围的仅有的限制是所附权利要求中所出现的那些。
【主权项】
1. 一种用于实施筛选方法的试剂盒，所述试剂盒包括多组独特可鉴别微粒，其中在一 组中的所述微粒具有相同独特可鉴别特征，并且其中一组或多组包括两个或更多个微粒亚 组，每个所述亚组呈现至少一种独特的序列特异性寡核苷酸（SSO)，其经选择在生物样品中 与组织分型抗原等位基因杂交，以及其中在与所述组织分型抗原等位基因结合时所述SSO 在组织分型抗原等位基因与SSO之间生成代表杂交的信号。2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述序列特异性寡核苷酸（SSO)是探针或引物。3. 根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述组织分型抗原等位基因选自：HLA抗原、HLA 等位基因、HNA抗原、HNA等位基因、血型抗原、TCR或KIR。4. 根据权利要求1所述的试剂盒，其中一组独特可鉴别微粒包含以不同于约1:1的固 定数值比例呈现的至少两个微粒亚组。
【专利摘要】<b>本发明涉及使用多组微粒筛选结合相互作用的方法，其中所述组具有相同的可鉴别特征，并且其中多组中的一组包括微粒亚组，所述亚组呈现至少一种作为生物样品中靶分子结合对象的独特探针。具体来说，本发明提供使用这些多组微粒在供体组织或受体组织中检测组织分型抗原的方法。</b>
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105112503
【申请号】CN201510411779
【发明人】J.-H.李, T.农, T.陈
【申请人】一兰姆达公司
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2008年5月1日
【公告号】CA2686211A1, CN101802217A, CN101802217B, EP2152908A1, EP2152908A4, US8748090, US20090142762, US20140272976, WO2008137530A1