cxc 趋化因子抗体的制作方法
【专利说明】Pan-ELR+CXC趋化因子抗体
[0001] 本发明涉及针对ELR+ CXC趋化因子的抗体，以及它们在治疗由ELR+ CXC趋化因 子介导发病的疾病中的用途。
[0002] ELR+ CXC趋化因子(这样称谓是因为该趋化因子家族成员都具有紧邻它们的CXC 基序的E-L-R氨基酸基序)在各种发病机制中发挥重要作用，包括嗜中性粒细胞向炎症和血 管生成位点的迀移。嗜中性粒细胞促进几种急性和慢性炎症/自身免疫性疾病的发病，诸 如炎性肠病（IBD)、牛皮癣和掌跖脓疱病。ELR+ CXC趋化因子还在肿瘤生成和肿瘤转移中 发挥关键作用。这些趋化因子在肿瘤中高表达。在肿瘤环境中，ELR+ CXC趋化因子涉及多 个通路，例如血管生成、内皮细胞和白细胞在肿瘤部位的移动和侵袭，以及肿瘤细胞的增殖 和存活。
[0003] 趋化因子分为4个亚家族：CXC、CC、（X)C和CX3C。在CXC趋化因子中，一个氨基 酸隔开前两个半胱氨酸("CXC基序")。ELR+ CXC趋化因子是CXCR1和/或CXCR2趋化因子 受体的配体，其是特异性结合ELR+ CXC趋化因子的G-蛋白偶联的7种跨膜结构域型受体。 所述7种人ELR+ CXC趋化因子是人Gro-a (也称为CXCL1)、人Gro-0 (也称为CXCL2)、 人 Gro- y (也称为 CXCL3 )、人 ENA-78 (也称为 CXCL5 )、人 GCP-2 (也称为 CXCL6 )、人 NAP-2 (也称为CXCL7)和人IL-8 (也称为CXCL8)。所有的ELR+ CXC趋化因子都结合CXCR2受体； 此外，一些ELR+ CXC趋化因子结合CXCR1和CXCR2受体两者（即，CXCL6和CXCL8)，它们都 促进活化途径中的冗余。
[0004] 先前已经描述了结合个别ELR+ CXC趋化因子的抗体。在早期的临床实验中已 经评价了针对CXCL8 (IL-8)的两种单克隆抗体在炎症疾病中具有效力（J Leuk Biol 66:401-410; J Immunol 181:669-679)。此外 TO 2008/130969 公开了 结合人 IL-8 (CXCL8)、人 Gro- a (CXCL1)、人 Gro- 0 (CXCL2)、人 Gro- y (CXCL3)和人 ENA-78 (CXCL5) 的抗体。但是，该公开没有证实该抗体紧密结合GCP-2 (CXCL6)，并且没有提及对NAP-2 (CXCL7)的结合。
[0005] 但是，尚未公开能够结合并中和所有7种人ELR+ CXC趋化因子的抗体。靶向一种 或一些人ELR+ CXC趋化因子使得其它ELR+ CXC趋化因子有机会引发多种生物学功能。中 和所有7种ELR+ CXC趋化因子可以影响CXCR1+或CXCR2+细胞迀移到炎症部位的能力，并 且可以抑制血管生成。鉴于在CXCR1和CXCR2受体活化通路中显著的冗余，对于结合所有7 种人ELR+ CXC趋化因子的具有特异性和高亲和力的抗体仍然存在需要。对中和所有7种 人ELR+ CXC趋化因子的抗体存在需要。对于物理性能稳定的抗体也存在需要。因此，希望 提供能够结合并中和所有7种人ELR+ CXC趋化因子并且物理性能稳定的s印ta-特异性抗 体。
[0006] 本发明提供了中和人 Gro-a、Gr〇-0、Gr〇-y、ENA-78、GCP-2、NAP-2 和 IL-8 的抗 体。本发明还提供了中和 Gro-a、Gr〇-0、Gr〇-y、ENA-78、GCP-2、NAP-2 和 IL-8 的抗体，其 中所述抗体在下列氨基酸处结合IL-8 (SEQ ID NO: 27) :Arg 6、Ile 10、Ala 35、Ile 40。 本发明还提供了中和人Gro- a、Gro- 0、Gro- y、ENA-78、GCP-2、NAP-2和IL-8的抗体，其 中所述抗体在下列氨基酸处结合IL-8 (SEQ ID NO: 27) :Arg 6、lie 10、Ala 35、lie 40 和 Leu 49。
[0007] 本发明提供了抗体，其包含轻链和重链，其中所述轻链包含轻链可变区（LCVR) 并且所述重链包含重链可变区（HCVR)，其中所述LCVR包括IXDR1、IXDR2、IXDR3并且所 述 HCVR 包括 HCDR1、HCDR2、HCDR3,其中 LCDR1 是 RASQSISNNLH (SEQ ID N0 :7)，LCDR2 是 YTSRSVS(SEQ ID N0:8)，LCDR3 是 GQNNEWPEV(SEQ ID N0:9)，HCDR1 是 GYEFTSYWIH(序列 ID NO :10)，HCDR2 是NISPNSGSANYNEKFKS(SEQ ID NO :11)，并且HCDR3 是EGPYSYYPSRXaaYYGSDL (SEQ ID N0:20)，其中 Xaa 是 E 或 Q〇
[0008] 在另一方面，本发明提供了一种抗体，其中HCVR的氨基酸序列是SEQ ID NO: 2或 SEQ ID NO: 14。本发明还提供了一种抗体，其中LCVR的氨基酸序列是SEQ ID NO: 4或 SEQ ID NO: 16〇
[0009] 本发明提供了一种抗体，其中重链的氨基酸序列是SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 13。本发明还提供了一种抗体，其中轻链的氨基酸序列是SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 15。
[0010] 本发明还提供了一种DNA分子，所述DNA分子包含编码具有SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 13的氨基酸序列多肽的第一多核苷酸序列；和包含编码具有SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 15的氨基酸序列多肽的第二多核苷酸序列。
[0011] 本发明提供了包含上述DNA分子的哺乳动物细胞，其中所述细胞能够表达抗体， 所述抗体包含具有SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0: 13的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID N0: 3或SEQ ID NO: 15的氨基酸序列的轻链。已知能够表达功能性免疫球蛋白的哺乳动物宿 主细胞包括中国仓鼠卵巢（CH0)细胞、C0S细胞和NS0细胞。用于本发明的优选的宿主细胞 是NS0细胞。
[0012] 本发明进一步提供了用于生产包含氨基酸序列是SEQ ID N0: 3或SEQ ID N0: 15 的轻链和氨基酸序列是SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 13的重链的抗体的方法，所述方法包 括在使得抗体表达的条件下培养上述哺乳动物细胞并回收表达的抗体。
[0013] 本发明提供一种治疗溃疡性结肠炎、肾癌或卵巢癌的方法，包括对有需要的患者 施用治疗有效量的本发明的抗体。
[0014] 本发明进一步提供了用于治疗的本发明的抗体。此外，本发明提供了用于治疗溃 疡性结肠炎、肾癌或卵巢癌的本发明的抗体。此外，本发明提供了本发明的抗体在制备用于 治疗溃疡性结肠炎、肾癌或卵巢癌的药物中的用途。
[0015] 本发明提供了包含本发明的抗体和一种或多种药学可接受的载体、稀释剂或赋形 剂的药物组合物。
[0016] 如本文所用，术语"人ELR+ CXC趋化因子"意在指具有E-L-R基序并结合CXCR1 和/或CXCR2受体的7种已知的CXC趋化因子。人ELR+ CXC趋化因子是人Gro-a(也称 为CXCL1) (SEQ ID N0:21)、人Gro-0(也称为CXCL2) (SEQ ID N0:22)、人Gro-y(也称 为CXCL3) (SEQ ID N0:23)、人ENA-78(也称为CXCL5) (SEQ ID N0:24)、人GCP-2(也称 为CXCL6) (SEQ ID N0:25)、人NAP-2(也称为CXCL7) (SEQ ID N0:26)和人IL-8 (也称为 CXCL8)(SEQ ID N0:27)。本文中所有7种人ELR+ CXC趋化因子统称为"人pan-ELR+ CXC 趋化因子"。
[0017] 如本文所用术语"抗体"意在指包含四条多肽链(通过二硫键互相连接的两条重 (H)链和两条轻（L)链）的单克隆免疫球蛋白分子。每条重链包含重链可变区（HCVR)和 重链恒定区。所述重链恒定区包括三个结构域，CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变 区（LCVL)和轻链恒定区，CL。HCVR和LCVR区可以进一步细分为高变区，称为互补决定区 (⑶R)，其间散布更保守的称为框架区（FR)的区域。每个HCVR和LCVR由三个⑶R和4个 FR构成，按照下列顺序从氨基端向羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。HCVR 中的 CDR 区称为 HCDR1、HCDR2 和 HCDR3。LCVR 中的 CDR 区称为 LCDR1、LCDR2 和 LCDR3。 CDR包含与抗原形成特异性相互作用的大部分残基。对于抗体目前有三种用于序列划分的 CDR 排列系统。Kabat CDR 定义（Kabat 等，"Sequences of Proteins of Immunological Interest, " National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))基于抗体序列可 变性。Chothia CDR定义（Chothia 等，"Canonical structures for th