EP蛋白W及人PAEP蛋白的部 分肤。所述PAEP蛋白的部分肤含有与骨关节炎相关的功能域。
[0031] "PAEP蛋白"包括人PAEP蛋白化及人PAEP蛋白的任何功能等同物。所述功能等 同物包括人PAEP蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物，等位变异体、天 然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与人PAEP的DNA杂交的DNA所编码的蛋 白质。
[0032] 优选地，PAEP蛋白是具有下列氨基酸序列的蛋白质：
[0033] (1)由序列表中SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0034] 似将SEQIDNO. 2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或 缺失和/或添加且与SEQIDNO. 2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQIDNO. 2所示 的氨基酸序列衍生的蛋白质。取代、缺失或者添加的氨基酸的个数通常为1-50个，较佳地 1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个。
[0035] (3)与SEQIDNO. 2所示的氨基酸序列具有至少80%同源性（又称为序列同一 性），更优选地，与SEQIDNO. 2所示的氨基酸序列至少约90%至95%的同源性，常为96%、 97 %、98 %、99 %同源性的氨基酸序列构成的多肤。
[0036] 在本发明的具体实施方案中，所述PAEP蛋白是具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序 列的蛋白质。
[0037] 通常，已知的是，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。 本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、 缺失、插入、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相 似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。
[0038] 通过添加一个氨基酸或多个氨基酸残基修饰的蛋白质的例子是PAEP蛋白的融合 蛋白。对于与PAEP蛋白融合的肤或者蛋白质没有限制，只要所得的融合蛋白保留PAEP蛋 白的生物学活性即可。
[0039] 本发明的PAEP蛋白也包括对SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列的非保守修饰，只要 经过修饰的蛋白质仍然能够保留PAEP蛋白的生物学活性即可。在此类修饰蛋白质中突变 的氨基酸数目通常是10个或者更少，例如6个或者更少，例如3个或者更少。
[0040] 在本发明的上下文中，"诊断骨关节炎"既包括判断受试者是否已经患有骨关节 炎、也包括判断受试者是否存在患有骨关节炎的风险。
[0041] 在本发明的上下文中治疗骨关节炎"从疾病的状态变化来分，可W包括疾病的 缓解、疾病的完全治愈。
[0042] 本发明的优点和有益效果：
[0043] 本发明首次发现了PAEP基因表达与骨关节炎相关，通过检测受试者滑膜组织中 PAEP的表达，可W判断受试者是否患有骨关节炎、或者判断受试者是否存在患有骨关节炎 的风险，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。 W44] 本发明发现了一种新的分子标记物-PAEP基因，相比传统的检测手段，基因诊断 更及时、更特异、更灵敏，能够实现骨关节炎的早期诊断，从而降低骨关节炎的死亡率。
【附图说明】
[0045] 图1显示利用QPCR检测PAEP基因在滑膜细胞中的表达情况；
[0046] 图2显示利用Western blot检测PAEP蛋白在滑膜细胞中的表达情况；
[0047] 图3显示利用QPCR检测PAEP基因的转录情况； W48] 图4显示利用Western blot检测PAEP蛋白的过表达情况； W例图5显示滑膜液对OA成纤维样滑膜细胞的增殖作用；
[0050] 图6显示PAEP基因过表达对刺激条件下的OA成纤维样滑膜细胞增殖的抑制作 用；
[0051] 图7显示PAEP基因过表达对OA成纤维样滑膜细胞增殖的抑制作用。
[0052] 具体的实施方式
[0053] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。W下实施例仅用于说明本 发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册（New化rk:ColdSpringHarborL油oratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0054] 实施例1 OA滑膜组织和正常滑膜组织中PAEP基因的表达差异 阳化5] 60例OA患者的滑膜组织来自于北京协和医院骨科行膝关节置换或滑膜切除术的 OA病人。所用病例符合Altam提出的关于OA的诊断标准。40例正常滑膜组织来自于北京协 和医院骨科，为外伤手术病人关节滑膜组织。OA患者滑膜液（S巧高速离屯、后取上清，-80°C 储存待用。本研究中所用临床样本，均对患者进行知情告知并经本院伦理委员会通过。
[0056] UPAEP基因转录水平的检测
[0057] 1. 1滑膜组织细胞体外培养
[0058] 将无菌获取的滑膜组织用PBS清洗后，用无菌手术剪刀反复剪切成约ImmXlmmX Imm的组织块，加入胶原酶II(0. 5mg/ml)37°C、消化化后，经200目纱网过滤，离屯、去上清 后，将细胞重悬于DMEM培养液，置于37°C，5 %C〇2细胞培养箱内培养。当细胞长成梭形并 成片后，进行传代培养。当细胞传至第3代后，分别加入FITC标记的小鼠抗人CD3、CD14、 CD19和PE标记的小鼠抗人CDl化进行标记，流式细胞仪检测鉴定。上述4种标记均为阴性 的细胞为成纤维样滑膜细胞（Fibroblast-likeSynovio巧tesJL巧用于本研究。
[0059] 1. 2 总RNA提取 W60] 利用QIAGEN公司的组织/细胞总RNA提取试剂盒提取OA患者滑膜组织细胞和正 常滑膜组织细胞的总RNA。
[0061] 1.3逆转录
[0062] 利用TAKARA公司的逆转录试剂盒进行RNA的逆转录。
[0063] 1. 4QPCR W64] (1)引物设计 阳0化]根据Genbank中PAEP基因和GAPDH基因的编码序列设计QPCR扩增引物，由上海 生工生物工程技术服务有限公司合成。具体引物序列如下：
[0066] PAEP基因：
[0067]正向引物为 5'-GCTGTGTTGAGAAGAAGGT-3'（沈QIDNO. 3);
[0068]反向引物为5' -TTCGCCACCGTATAGTTG-3'（沈Q ID NO. 4)，
[0069] GAP畑基因：
[0070]正向引物为 5' -TTTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3'（沈QIDNO.5);
[0071] 反向引物为 5, -GGTGGAATCATATTGGAACA-3'（SEQIDNO. 6)。 阳0巧 似按照表1配制PCR反应体系：
[0073] 其中，SYBRGreen聚合酶链式反应体系购自Invitrogen公司。
[0074] 表1PCR反应体系 阳0巧]
[0076] (3)口〇?反应条件：95°(：10111111，（95°(：153,601：603)*46个循环。^5￥81?6的611 作为巧光标记物，在Li曲t切cler巧光定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和 电泳确定目的条带，AACT法进行相对定量。
[0077] 1. 5统计学方法
[0078] 实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是W平均值+标准差的方式来表 示，采用SPSS13. 0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0. 05 时具有统计学意义。 阳0巧]1. 6结果
[0080] 结果如图1所示，与正常滑膜组织相比，骨关节炎滑膜组织细胞中PAEP基因表达 量显著降低，差异具有统计学意义（P<〇. 05)。
[0081] 2、PAEP基因表达--蛋白水平的检测 阳0間 2. 1步骤：使用常规的westernblot进行PAEP蛋白水平的检测。 阳〇8引 2. 2统计学处理
[0084] 将蛋白条带的灰度值使用ImageJ软件进行分析，W0 -actin为内参，将PAEP蛋 白条带的灰度值进行归一化处理。实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是W平均 值+标准差的方式来表示，采用SPSS13. 0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采 用t检验，