miRNA在急性髓系白血病诊断和治疗中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药领域，设及一种miRNA在急性髓系白血病诊断和治疗的应 用，具体地设及miRNA-1277在急性髓系白血病诊断和治疗的应用。
【背景技术】
[0002] 急性白血病是起源于造血干细胞的克隆性恶性疾病，骨髓中白血病细胞异常增殖 致使正常造血受抑，临床表现为贫血、出血、感染等。急性髓系白血病（AML)是最常见的成 人急性白血病，近年来AML发病率呈逐渐上升的趋势，尽管现有治疗方法伎患者完全缓解 率可达50%~70%，但该病病死率仍较高，针对不同患者实施个体化分层治疗成为人们关 注的问题。综合研究基因对AML发生发展的作用及其预后影响，有助于探寻有效的抗白血 病血管生成治疗祀点，从而进一步指导临床个体化治疗。
[0003]microRNAs(miRNAs)是一类含量丰富的非蛋白编码小分子RNA，miRNAs主要是与 祀mRNA的3'-UTR区域结合，能够抑制mRNA的翻译或直接使mRNA降解，调节多种生物功 能。据估计，生物体内约有1/3的基因受miRNA的调控。
[0004] 检测miRNA的表达水平可W为癌症的临床诊断提供参考。而miRNA的异常表达直 接导致一些与疾病发生相关基因的表达异常，诱发癌症的发生。已有报道证明miRNA可W 通过调控祀基因mRNA的表达，在急性髓系白血病中起重要作用。在未来临床治疗中，miRNA 不仅可W成为新的急性髓系白血病早期诊断和疾病进程相关的标记物，而且也有望通过改 变miRNA的表达或者其祀基因的表达治疗急性髓系白血病等疾病。寻找和鉴定与急性髓系 白血病发生相关的miRNA及其祀基因为miRNA的临床治疗提供基础。
【发明内容】
[0005] 为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供miRNA-1277在急性髓系白血 病诊断和治疗中的应用。相比传统的急性髓系白血病的诊断方法，使用miRNA来诊断急性 髓系白血病具有及时性、灵敏性，从而使患者在疾病早期就能知晓疾病风险，从而采取相应 的预防和治疗措施。
[0006] 为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
[0007] 本发明提供了miRNA-1277在制备诊断急性髓系白血病的产品中的应用，所述 miRNA-1277 选自W下组中的至少一种：miRNA-1277 初始miRNA、miRNA-1277 前体miRNA、 成熟miRNA-1277 ;所述miRNA-1277初始miRNA能在人细胞内被剪切并表达成成熟 miRNA-1277 ;所述miRNA-1277前体miRNA能在人细胞内被剪切并表达成成熟miRNA-1277。
[0008] 进一步，所述miRNA-1277是成熟miRNA-1277,核巧酸序列如序列表中的SEQ ID NO. 1所示。
[0009] 应当知道，本发明的miRNA-1277包括组成型核酸分子的功能等同物，即变体，其 显示完整miRNA-1277核酸分子相同的功能，它们可能通过核巧酸残基的缺失、置换或者插 入而突变。
[0010] 本领域人员熟知，为了保证miRNA的稳定性，可W在miRNA的一端或者两端增加保 护性碱基，如TT，也可对miRNA碱基进行修饰，但是不影响miRNA的功能。因此，本领域技术 人员熟知，在不影响miRNA-1277功能的条件下，对miRNA-1277进行碱基修饰或者在两端增 加碱基获得的序列同样包含在本发明的保护范围之内。
[0011] 在本发明的一些具体的实施方式中，所述miRNA-1277是成熟miRNA-1277。所述成 熟miRNA-1277包括miRNA-1277-5p、miRNA-1277-3p，它们共同享有共同的种子序列。
[0012] 虽然在某些【具体实施方式】中所使用的是成熟miRNA-1277,但是本领域技术人员可 W预期，初始miRNA(pri-miRNA-1277)、前体miRNA(pre-miRNA-1277)将可W获得与成熟 miRNA-1277同样的技术效果，因为细胞有能力进一步将初始miRNA(pri-miRNA-1277)、前 体miRNA(pre-miRNA-1277)加工为成熟miRNA-1277。
[0013] 本发明的miRNA-1277核酸分子可WW单链或双链的形式存在。成熟的 miRNA-1277主要呈单链形式，而miRNA-1277前体是部分自互补的，W形成双链结构。本发 明的核酸分子可W是RNA、DNA、PNA、LNA的形式。
[0014] 本发明提供了miRNA-1277在高通量测序平台中的应用。通过高通量测序能获知 待检测样本中miRNA-1277的表达水平，将待测样本的结果同健康人的样本相比，容易判断 待测样本是否患有急性髓系白血病W及患急性髓系白血病的风险。因此，通过高通量测序 获得miRNA-1277表达水平与急性髓系白血病相关性的应用同样包含在本发明的保护范围 之内。
[0015] 本发明提供了一种诊断急性髓系白血病的产品，所述产品能够通过检测 miRNA-1277的表达水平来诊断急性髓系白血病。
[0016] 进一步，上面所述的产品包括忍片或试剂盒。其中，所述忍片包括固相载体；W及 固定在所述固相载体上的寡核巧酸探针，所述寡核巧酸探针包括特异性地对应于上面所述 的miRNA-1277的部分或全部序列。所述试剂盒包括用于检测上面所述的miRNA-1277的表 达水平的试剂。
[0017] 进一步，所述检测miRNA-1277表达水平的试剂包括针对miRNA-1277的引物和/ 或探针。所述试剂还包括针对现有技术中已经报道的诊断急性髓系白血病miRNA的引物和 /或探针。将多种miRNA的检测引物和/或探针放置在同一试剂盒中通过检测多种miRNA 指标联合诊断急性髓系白血病的情况也包含在本发明的保护范围之内。
[0018] 进一步，上面所述的寡核巧酸探针还可包括针对现有技术中已经报道的可用于诊 断急性髓系白血病的miRNA的寡核巧酸探针。将多种miRNA的检测探针放置在同一忍片上 通过检测多种miRNA指标联合诊断急性髓系白血病的情况也包含在本发明的保护范围之 内。
[0019] 进一步，所述固相载体包括所述固相载体可采用基因忍片领域的各种常用材料， 例如但不限于尼龙膜，经活性基团（如醒基、氨基等）修饰的玻片或娃片、未修饰的玻片、塑 料片等。
[0020] 所述的miRNA忍片的制备可采用本领域已知的生物忍片的常规制造方法，例如， 如果固相载体采用的是修饰玻片或娃片，探针的5'端含有氨基修饰的聚dT串，可将寡 核巧酸探针配制成溶液，然后采用点样仪将其点在修饰玻片或娃片上，排列成预定的序 列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到本发明的miRNA忍片。如果核酸不含氨 基修饰，则其制备方法也可参照：王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》；J.L.erisi，V.R.Iyer，P. 0.BROWN.Exploringthemetabolicandgeneticcontrolof geneexpressiononagenomicscale.Science, 1997 ;278 :680和马立人，蒋中华主编.生 物忍片.北京：化学工业出版社，2000,1-130。
[0021] 本发明的miRNA-1277可W是天然的或是人工合成的，或者使用可W表达 miRNA-1277的DNA片段的载体转染细胞获得。所述载体包括病毒载体、真核表达载体。
[0022] 病毒载体可W是任何适当的载体，包括但不限于逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺 病毒相关病毒载体、瘤疹病毒（例如单纯瘤疹病毒、痘苗病毒及EB病毒）载体、甲病毒载 体。
[0023] 真核表达载体可W是任何适当的表达载体，包括但不限于pCMV-Myc表达载体、 PCDNA3. 0表达载体、PCDNA3. 1表达载体、pEGFP表达载体、pEFBos表达载体、pTet表 达载体、PTRE表达载体、或者在公知表达载体的基础上经改造的载体，比如地in438、 PCAMBIA1301等。
[0024] 可W表达miRNA-1277的DNA片段可W通过如下方式获取：从miRNA数据库中 (ht1:p: //microrna.sanger.ac.uk/sequences/)寻找miRNA-1277 在基因组上的位置及 具体序列信息，根据基因组序列确定miRNA-1277初始miRNA的位置，在miRNA-1277初始 miRNA位置的上下游500-80化P区间内设计特异性引物，扩增引物中间的序列即可获得表 达miRNA-1277 的DNA片段。
[00巧]本发明提供了上面所述的miRNA-1277在制备治疗急性髓系白血病药物中的应 用。
[0026] 进一步，所述药物包含促进所述miRNA-1277表达或增强miRNA-1277功能的试剂。 所述促进miRNA-1277表达或增强