一株高效共发酵葡萄糖和木糖的重组酿酒酵母菌株及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一株酿酒酵母及其应用，尤其设及一株高效共发酵葡萄糖和木糖的重 组酿酒酵母菌株及其应用，属于微生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 当前，开发利用可再生能源已成为世界各国保障能源安全、加强环境保护、应对气 候变化的重要措施。生物燃料乙醇，由于其独特的车用属性，是公认的很有发展前景的可再 生生物能源之一。由于W玉米、小麦、木馨、红馨等粮食及非粮淀粉为原料的第1代、1. 5代 燃料乙醇的生产不可避免地存在"与人争粮"、"与粮争地"的问题，均不能得到大规模发展， 因此W储量丰富且廉价的可再生木质纤维素生物质为原料进行第二代燃料乙醇的生产被 认为是燃料乙醇可持续发展的必然选择。
[0003]酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae)是传统的乙醇生产菌株，也是二代燃料 乙醇生产的首选发酵微生物。然而，其真正用于二代燃料乙醇的生产需要解决两方面的难 题：首先是木糖代谢问题，木糖是木质纤维素原料中含量仅次于葡萄糖的单糖，对其有效的 代谢和发酵可W显著降低二代燃料乙醇的生产成本从而提高其经济竞争力，然而，由于缺 乏木糖代谢相关基因，天然酿酒酵母并不能很好的代谢木糖；其二是抑制物问题，木质纤维 素原料在预处理及酶解过程中，会产生大量对微生物生长及发酵有抑制作用的化合物，故 增加酿酒酵母自身对运些抑制物的耐受性可W提高发酵过程中乙醇的生成速率。因此，开 发一株能高效共发酵葡萄糖和木糖同时也具有较高抑制物耐受性的酿酒酵母是目前重点 研究的课题，高效共发酵葡萄糖和木糖的酿酒酵母菌株也是第二代燃料乙醇经济有效生产 的必要条件。
【发明内容】
[0004]针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一株高效共发酵葡萄糖和木糖 的重组酿酒酵母菌株及其应用。
[0005]本发明所述的高效共发酵葡萄糖和木糖的重组酿酒酵母菌株，其特征在于：该菌 株名为酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae)LF1，已于2015年09月08日保藏在"中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、（保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号 院3号）"，保藏编号为CGMCCNo. 11331。
[0006] 上述高效共发酵葡萄糖和木糖的重组酿酒酵母菌株构建的主要技术思路是：将 含有异源木糖异构酶基因Ru-xylA表达框的DNA片段整合到酿酒酵母菌株BSIF染色体的 閒013基因座位；进而将含有非氧化憐酸戊糖途径四个基因串联表达框的两个相应DNA片 段整合到上述操作获得的菌株染色体的GRE3基因座位的一部分；进而将含有异源木糖异 构酶基因Ru-xylA表达框的DNA片段整合到上述操作获得的菌株染色体上的逆转录转座子 Tyl上的5-sequence区域；进而用含有TEF1启动子的DNA序列转化上述操作获得的菌株， 将该菌株染色体中XKSl基因的启动子替换为TEFl启动子；进而将上述操作获得的菌株在 木糖为唯一碳源培养基中进行长期驯化培养；进而将上述操作获得的菌株在预处理玉米賴 杆渐出液中进行长期驯化培养；进而用含有木糖专一性转运蛋白基因Mgt05196(N360巧表 达框的DNA片段整合到上述操作获得的菌株GRE3基因座位剩余的另一部分；进而将上述操 作获得的菌株在木糖为唯一碳源培养基中进行驯化培养。
[0007] 具体的，上述高效共发酵葡萄糖和木糖的重组酿酒酵母菌株的构建方法，步骤 是：
[0008] 构建质粒PXIP1和PXIP2,用限制性内切酶EcoRI和SphI酶切上述质粒，得到含有 异源木糖异构酶狂I,xyloseisomerase)基因Ru-xylA(专利公开号为US20120225452A1) 表达框的两个相应整合片段，将两个整合片段依次转化野生型二倍体酿酒酵母菌株BSIF， 得到重组菌株并命名为B-XI-6,其基因型为地〇13::XI;用限制性内切酶Smil分别消化 处理质粒PJPPP3和PJPPP4,得到含有非氧化憐酸戊糖途径四个基因（RPE1，服II，TALIW 及TKL1)串联表达框的两个相应整合片段，将两个整合片段依次转化菌株B-XI-6,得到重 组菌株并命名为B-XI-6P，其基因型为地〇13: :XI，gre3::PPP;通过融合PCR构建整合片段 RAl-KanMX-TEFlp-RA3 和RA2-KanMX-TEFlp-RA3,将两个整合片段依次转化菌株B-XI-6P， 得到重组菌株并命名为BSN0 (其两条同源染色体上木酬糖激酶基因XKS1的启动子替换为 组成型强启动子TEFlpromoter)，其基因型为地〇13: :XI，gre3: :PPP，XK;构建质粒pXI5， 用限制性内切酶EcoRI和SphI酶切质粒得到含有两个串联异源木糖异构酶基因Ru-xylA 表达框的整合片段，W菌株BSN0为基础，将此片段进行=轮整合，得到菌株并命名为BSN3， 其基因型为地〇13::XI，3S::XI，gre3::PPP，XK;W菌株BSN3为基础，对其在木糖为唯 一碳源培养基中进行长期驯化培养，筛选得到菌株并命名为XH7,其基因型为地〇13: :XI， 3 5 : :XI，gre3: :PPP，XK，AE 菌株XH7为基础，对其在预处理玉米賴杆渐出液中进行长期 驯化培养，筛选得到菌株并命名为XHR11，其基因型为地〇13: :XI，3 5 : :XI，gre3: :PPP，XK，AE-PCS;构建重组质粒PUC-N360F，用限制性内切酶Swal线性化所述质粒，所得整合片段转 化菌株XHR11，得到整合异源糖转运蛋白基因N360F(专利申请公开号CN104263739A)的重 组酿酒酵母菌株并命名为酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae)XHRll-N360F，其基因型 为地〇13: :XI，3 5 : :XI，gre3: :PPP，XK，AE-PCS，N360F菌株XHR11-N360F为基础，对其在 木糖为唯一碳源培养基中进行驯化培养，筛选得到菌株并命名为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)LFl，其基因型为地〇13: :XI，3 5 : :XI，gre3: :PPP，XK，AE-PCS，N360F，AE。
[0009] 本发明所述的高效共发酵葡萄糖和木糖的重组酿酒酵母菌株在W葡萄糖和木糖 为碳源的混合糖培养基中发酵生产乙醇的应用。
[0010] 本发明所述的高效共发酵葡萄糖和木糖的重组酿酒酵母菌株在木质纤维素水解 液中发酵生产乙醇的应用。
[0011] 上述高效共发酵葡萄糖和木糖的重组酿酒酵母菌株在W混合糖（80gLi葡萄糖、 40gLi木糖）为碳源、YEP(20gL1蛋白腺，lOgL1酵母提取物）为氮源、初始接种量为 0.5g化ycellwei曲tLi及摇瓶限氧条件下发酵，16小时即可耗尽培养基中全部葡萄糖 及绝大部分木糖巧5. 35% )，发酵液中乙醇浓度达到58. 74gL1，同时乙醇得率达到0. 472g giconsumedsugars,为最大理论乙醇得率的93%;在W木质纤维素为原料，5gLi尿素为 氮源、初始接种量为〇.5g化ycellwei曲tLi及摇瓶限氧条件下发酵生产乙醇时，本发明 所述的高效共发酵葡萄糖和木糖的重组酿酒酵母菌株LFl同样具有较好表现，其中在泉林 水解液原料中，菌株LF1发酵20小时消耗约86. 8%木糖，糖醇转化率为0. 480,达到理论值 的 94. 1 %。
[0012] 本发明所述的高效共发酵葡萄糖和木糖的重组酿酒酵母菌株LF1无论在没有抑 制物的混合糖培养基或是含有多种抑制物的多种木质纤维素水解液中，都具有提高的木糖 发酵能力。菌株LF1比文献报道的工程菌株具有更优的发酵能力，在相同发酵条件下，已报 道的Diao等的研究中，最优菌株CIBTS0735需要20小时才能代谢培养基中所有的80gL1 葡萄糖和40gLi木糖，乙醇得率为0.454ggiconsumedsugars,且其对葡萄糖和木糖的 利用具有明显的时间先后顺序值iaoetal.，2013)。而本发明所述的重组酿酒酵母菌株 LF1具有较强的葡萄糖木糖共发酵能力，在发酵12小时，葡萄糖完全耗尽，同时有约77. 6% (33. 24gLi)的木糖同时被利用。预示本发明公开的重组酿酒酵母菌株LF1已基本具备利 用木质纤维素原料发酵生产燃料乙醇的实际产业化潜力。
【附图说明】
[0013] 图1质粒YEp-CH的构建示意图及特征图。
[0014]其中：GALlp，GAL1 启动子；CYClt，CYC1 终止子；TEFlp，TEF1 启动子；TEFlt，TEF1 终止子。
[0015] 图2同源臂片段P册13-B1、B2、B3在酵母两条染色体上的相对位置。
[0016] 图3质粒PJFE3-XIH的构建流程图。
[0017] 图4质粒pUC-KanMXH-XI-3的构建流程图。
[001引图5质粒PXIP1和PXIP2的构建流程图。
[0019] 图6质粒PJPPP3和PJPPP4特征图。
[0020] 其中：TPIlp，TPI1 启动子；PGKlp，PGK1 启动子；FBAlp，FBA1 启动子；ADHlp，ADH1 启动子。
[0021] 图7同源臂片段GRE3-RA1、RA2及RA3在酵母两条染色体上的相对位置。
[002引 图8同源臂片段XKS1-RA1、RA2和RA3在酵母两条染色体上的相对位置。
[0023]图 9 整合片段RAl-KanMX-TEFlp-RA3 和RA2-KanMX-TEFlp-RA3 的构建过程。
[0024] 图10质粒pXIS的构建示意图。
[00巧]图11菌株BSN3在YEPX培养基中驯化过程中细胞量倍增时间灯）变化。
[0026] 图12菌株XH7在预处理玉米賴杆渐出液培养基中驯化过程中细胞量倍增时间灯） 变化。
[0027] 图13菌株XH7及其驯化培养物在预处理玉米賴杆渐出液固体平板上生长情况对 比。
[0028] 其中：(A)菌株XH7在预处理玉米賴杆渐出液固体平板上的生长情况；度）驯化培 养物在预处理玉米賴杆渐出液固体平板上生长情况。
[0029] 图14同源臂片段GRE3-RA4及RA3'在酵母两条染色体上的相对位置。
[0030] 图15GRE3