使用杂合chef1 启动子的改善重组蛋白表达的制作方法
【专利说明】使用杂合CHEF1启动子的改善重组蛋白表达
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[0002] 相关申请的交叉引用
[0003] 本申请要求于2013年3月12日提交的美国临时专利申请序列号61/777,603的 优先权的权益。所述优先权申请的公开内容以引用的方式并入本文。
技术领域
[0004] 本发明针对包含新颖启动子-增强子组合的表达载体，所述启动子-增强子组合 增强异源蛋白表达并且在重组蛋白生产的领域中具有实际应用。
【背景技术】
[0005] 通过转录、翻译、蛋白质折叠和/或分泌中的改善而增加的重组蛋白表达是基本 优先的用于在细胞系发展期间优化产量。中国仓鼠卵巢延长因子1-α (CHEFl)表达系统已 经被广泛使用以创建用于产生重组蛋白的临床细胞系。延长因子1-α (EF-Ia)基因在大 多数组织类型中高度表达，并且EF-I是人细胞中最丰富的蛋白质之一（Beck等，Molecular Systems Biology 7:549 ;2011)。CHEFl表达载体实现在中国仓鼠卵巢（CHO)细胞中以及 在非仓鼠细胞中的高水平重组蛋白表达。
[0006] CHEFl表达与生长相协调，使得滴定度增加由增加的体积产率来驱动。通常，蛋白 表达在生长的指数期早期启动并且在静止期期间下降且衰退。蛋白表达和细胞生长之间 的联系与天然EF-Ια基因的调控是一致的，所述天然EF-Ια基因被组成型表达以在核糖 体蛋白复合物中发挥作用。EF-Ia的表达已经被证明在转化的细胞（Sanders等，Nucleic Acids Research 20:5907 ;1992)和丝裂原刺激的细胞（Thomas 和 Thomas, Journal of CellBiology 103:2137 ;1986)中增加，这与EF-Ια在活跃生长细胞中的组成型表达是一 致的。除了生长的细胞的转录控制，胰岛素生长因子通过mRNA 5'非翻译区（5'UTR)来调控 EF-Ια 的翻译（Hammond 和 Bowman, Journal of Biological Chemistry 25:17785 ;1988; Proud 和 Denton, Biochemical Journal 328:329 ;1997)。通过在 5'UTR 中发现的多啼啶 系统（TOP)序列来实现这种翻译控制（Mariottini 和 Amaldi, Molecular and Cellular Biology 10:816 ;1990)。
[0007] CHEFl表达系统已经示出能够实现比采用其他常用启动子（例如，巨细胞病毒 (CMV)、人EF-Ια以及猿猴病毒40(SV40)启动子）的载体更高水平的蛋白表达（Running Deer 和 Allison, Biotechnology Progress 20:880 ;2004)。CMV 启动子是用于重组蛋白 表达最广泛使用的启动子之一。例如，谷氨酰胺合成酶（GS)系统使用鼠科或人CMV启动 子（Kalwy，S.，''Towards stronger gene expression-a promoter's tale, 〃第 19 届欧 洲动物细胞技术（ESACT)学院会议，2005)。商业表达质粒pcDNA?3 (Life Technologies Corp.，Carlsbad, CA)携带来源于之前描述的主要立即早期（IE)基因 （GenBank Accession#K03104.1)的 CMV 启动子（Boshart 等，Cell 1985;4:521)。另一个常用的 CMV 启动子来源于人CMV株AD 169 (GenBank Accession#X17403. 1)，也称为人疱疹病毒5。
[0008] 含有CHEFl调控DNA的载体导致重组蛋白的改善的表达与来自CMV控制的质粒相 比大多达280倍（Running Deer和Allison, 2004)。使用CHEFl驱动载体已经在不同真核 细胞系（包括非仓鼠细胞）中实现各种目标蛋白质（包括分泌和膜结合蛋白）的增加的表 达。转染效率CHEFl与CMV载体之间是可比的，但是在用CHEFl载体转染的克隆中的表达 水平通常一致地更高。
[0009] 尽管CHEFl载体在驱动高水平表达重组蛋白中证明成功，但还存在开发改善的表 达系统的持续需要。
【发明内容】
[0010] 本公开提供一种用于高水平表达重组蛋白的表达载体。在各种方面中，表达载体 包含CHEFl转录调控DNA元件和CMV启动子和/或人腺病毒三联前导（AdTPL)序列。
[0011] 在各种方面中，根据本公开的表达载体包含5' CHEFl转录调控DNA。在各种实施方 案中，5'CHEFl转录调控DNA包含SEQ ID NO: 1。在各种实施方案中，5'CHEFl转录调控DNA 包含位于SEQ ID NO: 1中的位置1与位置11，716之间的DNA。在各种方面中，5'CHEFl转 录调控DNA包含位于SEQ ID NO: 1中的位置10, 744与位置11，716之间的DNA。在各种实 施方案中，5'CHEFl转录调控DNA包含SEQ ID N0:2。在各种实施方案中，5'CHEFl转录调控 DNA包含位于SEQ ID NO: 2中的位置1与位置4057之间的DNA。
[0012] 在各种方面中，根据本公开的表达载体还包含3' CHEFl转录调控DNA。在各种实 施方案中，3'CHEFl转录调控DNA包含SEQ ID NO: 3。在各种实施方案中，3'CHEFl转录调 控DNA包含位于SEQ ID NO: 3中的位置1与位置4180之间的DNA。在各种方面中，3'CHEFl 转录调控DNA包含位于SEQ ID NO: 3中的位置1与位置209之间的DNA。在各种实施方案 中，3' CHEFl转录调控DNA包含约4. 2千碱基。
[0013] 在各种实施方案中，根据本公开的表达载体包含CHEFl转录调控DNA和CMV启动 子。在各种实施方案中，表达载体包含CHEFl转录调控DNA和AdTPL序列。在各种方面中， 表达载体包含CHEFl转录调控DNA、CMV启动子以及AdTPL序列。
[0014] 在各种方面中，在根据本公开的表达载体中，CMV启动子和/或AdTPL序列被插入 5' CHEFl转录调控DNA。在各种实施方案中，在包含有SEQ ID NO: 1列出的DNA的表达载体 中，SEQ ID NO: 1中的位置1与位置11，716之间的一个或多个碱基缺失和代替为CMV启动 子和/或AdTPL序列。在各种方面中，SEQ ID NO: 1中的位置10, 512与位置11，716之间 的一个或多个碱基缺失和代替为CMV启动子和/或AdTPL序列。在各种方面中，根据本公 开的表达载体包含在SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6和SEQ ID N0:7列出的一个 或多个多核苷酸。
[0015] 在各种实施方案中，根据本公开的表达载体还包含选择性标记基因。在各种实施 方案中，根据本公开的表达载体还包含编码目标蛋白质的多核苷酸，所述目标蛋白质可操 作地连接至5' CHEFl转录调控DNA、3' CHEFl转录调控DNA、CMV启动子，和/或AdTPL序列。
[0016] 本公开还提供用表达载体转化、转导或转染的宿主细胞，所述表达载体包含CHEFl 转录调控DNA和CMV启动子和/或AdTPL序列。在各种方面中，宿主细胞是原核细胞或真 核细胞。在各种方面中，宿主细胞是仓鼠细胞，并且在各种实施方案中，宿主细胞是中国仓 鼠卵巢（CHO)细胞。在各种方面中，宿主细胞是非仓鼠哺乳动物细胞。在各种实施方案中， 宿主细胞是人细胞。本公开的表达载体包含CHEFl转录调控DNA，所述CHEFl转录调控DNA 与CMV启动子和/或AdTPL序列结合实现宿主细胞的蛋白表达能力的协同增加。
【附图说明】
[0017] 图1示出包含5' CHEFl转录调控DNA和3' CHEFl转录调控DNA和CMV启动子的表 达载体PDEF85的图谱。CMV启动子代替载体pDEF38中的5' CHEFl DNA的1217个核苷酸 (从位置2866至位置4083)以创建pDEF85。将GPl和MAbl报告基因克隆至XhoI-XbaI 克隆位点内以制成表达载体PDEF85-GP1和pDEF85-MAbl。
[0018] 图2示出包含5' CHEFl转录调控DNA和3' CHEFl转录调控DNA、CMV启动子以及 AdTPL序列的表达载体pDEF86的图谱。CMV启动子和AdTPL序列代替载体pDEF38中的 5' CHEFl DNA的1217个核苷酸（从位置2866至位置4083)以创建pDEF86。将GPl和MAbl 报告基因克隆至XhoI - XbaI克隆位点内以制成表达载体pDEF86-GPl和pDEF86-MAbl。
[0019] 图3示出用载体pDEF38-GPl、pDEF85-GPl或pDEF86-GPl转染的CHO宿主细胞的 活力。所述细胞在非选择性⑶-CHMl加 HT的培养基中恢复2-3天，并且重悬浮于缺乏HT 的选择培养基中（传代数0)。如果细胞数量允许，细胞每2至3天传代。X-轴上提供传代 数，并且y-轴上示出细胞活力百分比。
[0020] 图4示出用载体pDEF38-GPl、pDEF85-GPl或pDEF86-GPl转染的CHO宿主细胞的 活力和产率。将复制转染池以12天分批补给生产模式运行，并且在第3、5和7天补给原料 C，以及在第0、3、5和7天补给原料CB至⑶-CHMl基础培养基中。在37°C下运行