多个碱基缺失和代替为CMV启动子和/或AdTPL序列。
[0062] 18.实施方案17所述的表达载体，其中位于序列ID NO: 1中的位置10, 512与位置 11，716之间的一个或多个碱基缺失和代替为CMV启动子。
[0063] 19.实施方案17所述的表达载体，其中位于序列ID NO: 1中的位置10, 512与位置 11，716之间的一个或多个碱基缺失和代替为AdTPL序列。
[0064] 20.实施方案17所述的表达载体，其中位于序列ID NO: 1中的位置10, 512与位置 11，716之间的一个或多个碱基缺失和代替为CMV启动子和AdTPL序列。
[0065] 21.前述实施方案中任一项所述的表达载体，其还包含序列ID NO: 4或与序列ID NO:4至少95%相同的多核苷酸。
[0066] 22.前述实施方案中任一项所述的表达载体，其还包含序列ID NO: 5或与序列ID NO: 5至少95 %相同的多核苷酸。
[0067] 23.前述实施方案中任一项所述的表达载体，其还包含序列ID NO: 6或与序列ID NO:6至少95%相同的多核苷酸。
[0068] 24.前述实施方案中任一项所述的表达载体，其还包含序列ID NO: 7或与序列ID NO: 7至少95 %相同的多核苷酸。
[0069] 25.前述实施方案中任一项所述的表达载体，其还包含选择性标记基因。
[0070] 26.前述实施方案中任一项所述的表达载体，其还包含编码目标蛋白质的多核苷 酸，所述目标蛋白质可操作地连接至5' CHEFl转录调控DNA、3' CHEFl转录调控DNA、CMV启 动子和/或AdTPL序列。
[0071] 27. -种用前述实施方案中任一项所述的表达载体转化、转导或转染的宿主细胞。
[0072] 28.实施方案27所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是原核细胞。
[0073] 29.实施方案27所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是真核细胞。
[0074] 30.实施方案29所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是仓鼠细胞。
[0075] 31.实施方案30所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是中国仓鼠细胞卵巢（CHO) 细胞。
[0076] 32.实施方案29所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是非仓鼠哺乳动物细胞。
[0077] 33.实施方案32所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是人细胞。
[0078] 根据本公开的一种表达质粒还描述于以下实施例中。所述实施例仅为阐述本发 明，而不旨在以任何方式限制本发明的范围。
[0079] 实施例
[0080] 基因序列和表达载体--将编码CMV启动子（SEQ ID NO: 4)和CMV-AdTPL启动子 (SEQ ID NO: 5)的DNA片段化学合成并且克隆至前述CHEFl表达载体pDEF38中（Running Deer和Allison, 2004)，从而创建称为pDEF85的CHEF1-CMV-启动子载体（图1)，以及 称为PDEF86的CHEFl-CMV-AdTPL启动子载体（图2)。使用标准分子生物学技术来创建 表达Fc-糖蛋白融合（GPl)和IgGl抗体（MAbl)的衍生载体（Maniatis等，J. Molecular Cloning:A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory. 545, 1982)并且将 所述载体称为 PDEF38-GP1、pDEF85-GPl、pDEF86-GPl、pDEF38-MAbl、pDEF85-MAbl 以及 pDEF86-MAbl〇
[0081] 细胞系构建--通过标准电穿孔方法将pDEF38-GPl、pDEF85-GPl、pDEF86-GPl、 pDEF38-MAbl、pDEF85-MAbl以及pDEF86-MAbl表达载体单独地转染至CHO DG44细胞中，在 含有次黄嘌呤和胸苷（HT)的非选择培养基中生长两天，并且随后在缺乏HT的培养基中选 择约两周。将所选择的细胞群体或转染池扩大并且分成生产模式培养物以评估产率，并且 还同时地分成用于单个细胞克隆的培养物。
[0082] 生产模式一一按照标准生物制造工艺来运行小规模分批补给生产模式以评估培 养物产率（滴定度）。将培养物以〇. 5百万细胞每毫升的种子密度接种到缺乏HT的化学限 定培养基（CD-CHM1，CMC Biologies, Bothell, WA)的摇瓶中。将培养物在37°C下运行3至 5天，并且随后转移至较低温度（30°C至34°C)下以减缓生长并且促进生产。用补充平衡的 原料 1(BF1, CMC Biologies)、高效原料 C(原料 C, Life Technologies, Grand Island, NY) 或细胞加强（CB, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)补给培养物以延长培养物健康 状态。在第3、5、7、10、12、14和16天收集用于滴定度和细胞密度的样品。所述研究在第12 至16天结束。将收获的上清液过滤通过0. 2微米的过滤器并且随后通过蛋白质A高效液 相色谱法（HPLC)测定GPl或MAbl生产。
[0083] 细胞系克隆--将选择的GPl-和Mbl-表达转染池稀释以接种单个细胞至96孔 板的个别孔中。将所述板在接种多达两周之后进行成像，以鉴定来自单个细胞的单克隆细 胞系。将含有单克隆集群的孔扩大，并且使用流式细胞术随机挑选或选择，以鉴定来自每个 转染池的高度表达细胞。将细胞系扩大以便在悬浮培养物中生长，并且分成生产模式培养 物以评估产率。
[0084] 流式细胞术一一用第2天的正常生长细胞执行荧光激活细胞分类术（FACS)分析， 所述第2天的正常生长细胞被收获并且用荧光抗IgGl Fc抗体（RPE)染色以检测重组GPl 和Mbl表达。
[0085] 结果和讨论
[0086] 使用标准DHFR选择方法使用表达载体pDEF38、pDEF85和pDEF86制成表达报告 蛋白GPl或Mbl的稳定细胞系。不使用氨甲喋呤，在缺乏次黄嘌呤和胸苷（HT)的培养基 中选择转染池。细胞活力在缺乏HT的培养基中下降，并且随后恢复为具有在群体中长出的 DHFR载体的细胞。转染培养物最初下降至约10%至约30%活力，并且随后通过在第12天 左右（第6代）获得大于90%的活力。与仅用CHEFl载体（pDEF38-GPl)转染的细胞相比， 用 CHEF1-CMV 载体（pDEF85-GPl)或 CHEFl-CMV-AdTPL 载体（pDEF86-GPl)转染的细胞的生 长对GPl表达构建体表现出类似的恢复，在恢复期之后具有一致的高活力（图3)。对于抗 体表达细胞系获得类似的结果（数据未示出）。
[0087] 将转染池直接设置成生产模式或进展成为单细胞克隆，并随后将克隆细胞系与生 产模式比较。图4示出，分批补给摇瓶生产模式生长与GPl表达池是相似的（图4A);然而， 收获时的蛋白表达（滴定度）（通常在接种后12至16天）是显著不同的。第12天收获的 用于CHEF1-CMV或CHEFl-CMV-AdTPL表达载体（pDEF85和pDEF86)的滴定度显著高于用于 标准CHEFl载体（pDEF38)的滴定度（图4C)。由来自CHEF1-CMV或CHEFl-CMV-AdTPL载 体的分批补给摇瓶的合并转染子产生的重组GPl蛋白质的量是标准CHEFl载体的约两倍。 CHEF1-CMV和CHEFl-CMV-AdTPL池的生长稍早些到达顶峰，并且表现出活力更快速下降（图 4B)。活力下降预期并不改善表达，反而可能是有害的。稍后实验表明，改善末梢活力增加 了针对CHEF1-CMV培养物的滴定度。
[0088] 如图5所见，在CHEF1-CMV和CHEFl-CMV-AdTPL载体情况下看到的滴定度的增加 是比产率增加的结果。将比产率计算为在整个细胞培养期间平均每天每细胞的微微克蛋白 质。在CHEF1-CMV (pDEF85)和CHEFl-CMV-AdTPL (pDEF86)构建体之间存在细微的表达差异， 这表明AdTPL序列的添加与比产率相关的可能益处。图1示出以微微克每细胞每天（PCD) 的比产率。使用CHEF1-CMV或CHEFl-CMV-AdTPL载体实现的比产率比CHEFl载体的比产率 大两倍以上。
[0091] 使用不同的报告蛋白质和改变的分批补给生产条件来确认具有CHEF1-CMV和 CHEFl-CMV-AdTPL的改善的表达。与补充有商业培养基（原料C)的细胞相比，在补充有CB 的⑶-CHMl基础培养基中生长的细胞证明类似的GPl产率曲线，所述CB在第4、6、8、10以 及12天补给专有的BFl补充物。图6表明，CHEFI-CMV和CHEFl-CMV-AdTPL载体培养物在 BFl过程中具有超过对照CHEFl载体的有所增加的GPl滴定度。
[0092] 在BF1过程中还测试利用CHEF I-CMV和CHEF I -CMV-AdTPL载体的抗体（MAb 1)生 产。用与GPl池相同的方法建立MAbl转染池，并且一旦从选择中完全恢复，则该MAbl转染 池进入分批补给摇瓶生产模式。如图7所示，CHEF1-CMV和CHEFl-CMV-AdTPL MAbl池产生 比第12天后pDEF38对照物产生更高滴定度的抗体。与糖蛋白生产相比，在表达抗体的转染 池中的产率曲线是新颖的，因为当细胞进入静止期时，抗体产率显著增加。当细胞培养物积 极生长时，可以看到与CHEFlMAbl池相比，用于CHEF1-CMV和CHEFl-CMV-AdTPL MAbl池的 较低的初始滴定度（第7天），随后当生长减缓并且在第10天后最终减缓时，CHEF1-CMV和 CHEFl-CMV-AdTPL培养物的产率快速增加（图7B)。甚至随着活细胞密度减小（图7A)，14 天时CHEF1-CMV和CHEFl-CMV-AdTPL池中的