产率增加，然而产率在CHEFl池中开始减缓，尽 管对于所有培养物来说，最终第14天的活力百分比是类似的（约80%存活，数据未示出）。
[0093] 克隆培养物由表达GPl和Mbl两者的转染池发展。通过对限制性稀释板成像 来鉴定单克隆细胞系，并且随后扩大成悬浮培养物。从每个pDEF38-MAbl和pDEF85-MAbl 转染池中随机选择十二个Mbl克隆培养物，并且在分批补给摇瓶生产模式中运行。克隆 CHEFl-启动子（pDEF38-MAbl)抗体生产与转染池曲线匹配，从而示出比在生长相期间的 pDEF85-MAbl克隆更高的表达，并且随后当培养物进入静止期时，减缓生产（图8B)。来自 CHEF1-CMV载体（pDEF85-MAbl)克隆的抗体产生显得与转染池十分类似，其中大部分抗体 表达是在第6天后，在指数生长减缓并且细胞转变为静止期后出现（图8A)。
[0094] 使用基于FACS的测定来选择表达GPl的克隆细胞系以检测在发展早期的GPl表 达。通过FACS平均荧光来筛选来自每个pDEF38-GPl和pDEF85-GPl转染池的超过100个 的克隆并且进行评级。基于来自每个组的FACS分析，前八名的GPl表达培养物进一步在使 用⑶-CHMl基础培养基和BFl原料的分批补给生产模式中进行检查（图9)。表2和表3示 出的平均滴定度和比产率，表明来自CHEF1-CMV启动子（pDEF85-GPl)的表达显著高于来自 单独CHEFl启动子（pDEF38-GPl)的表达，并且受比产率的增加所驱动。
[0099] 如前面实施例证实，新颖CHEF1-CMV和CHEFl-CMV-AdTPL表达载体增加在稳定CHO 细胞转染池中的糖蛋白和抗体两者的表达。与CHEFl-启动子池相比，来源于CHEF1-CMV 和CHEF I -CMV-AdTPL池的稳定的克隆细胞系还示出改善的蛋白表达。在CHEF I-CMV和 CHEFl-CMV-AdTPL克隆细胞系中的增加的表达是由与CHEFl-启动子相比较高的比产率所 导致，这表明具有CMV启动子的组合CHEFl转录调控DNA增加细胞表达能力，并且不只是改 善生长性能。来自CHEF1-CMV构建体的表达模式不同于单独CHEFl-启动子，其中最大表达 稍后在在细胞生长的静止期期间出现，这表明通过CHEF1-CMV-启动子的调节不同于来自 单独CHEFl的调节并且具备独特的重组蛋白生产特性。与单独CHEFl相比，来自CHEF1-CMV 的蛋白质的延迟的时间性表达是组合的调控元件改变CHEFl生长-依赖性表达的证据，因 此展示新的机制以控制CHEFl蛋白质产生。考虑到之前的发现，其中CHEFl启动子性能优 于CMV启动子（Running Deer和Allison, 2004)，由CHEFl和CMV的重组实现的高水平表达 是意想不到的。结合观察到的表达中的时间偏移，获得增加的比产率是有利的，因为培养物 补给条件可以针对生物制造过程中的二次生长以及生产进行优化。根据本公开的表达载体 包含CHEFl转录调控DNA和CMV启动子和/或AdTPL序列，因此，为在重组蛋白表达系统中 获得高滴定度和产率提供改善的选项。
[0100] 根据本公开，在此公开和要求保护的所有组合物可在无需过度实验的情况下制得 和实施。虽然本公开的组合物已依照具体实施方案进行了描述，但对本领域普通技术人员 显而易见的是，可以不背离本公开的概念和范围来制得所述组合物。更具体来说，显而易见 在化学上和生物学上均相关的某些多核苷酸可替代本文所述的多核苷酸，同时实现相同或 相似结果。本领域技术人员显而易见的所有这种相似的替代物和修改都被认为是在所附权 利要求书所界定的本发明的范围和概念之内。
[0101] 本文通篇所引用的参考文献均在某种程度上特定地以引用的方式并入本文，使得 所述参考文献对本文所陈述内容提供示例性程序或其他细节补充。
【主权项】
1. 一种表达载体，其包含中国仓鼠延长因子-Ia(CHEFl)转录调控DNA和巨细胞病毒 (CMV)启动子和/或腺病毒三联前导（AdTPL)序列。2. 如权利要求1所述的表达载体，其中所述CHEFl转录调控DNA包含5'CHEF转录调控 DNA03. 如权利要求2所述的表达载体，其中所述5'CHEFl转录调控DNA包含序列IDNO: 1 或与序列IDNO: 1至少95%相同的多核苷酸。4. 如权利要求2所述的表达载体，其中所述5'CHEFl转录调控DNA包含位于序列ID NO: 1中的位置1与位置11，716之间的DNA，或与位于序列IDNO: 1中的位置1与位置11，716 之间的DNA至少95 %相同的多核苷酸。5. 如权利要求4所述的表达载体，其中所述5'CHEFl转录调控DNA包含位于序列ID NO: 1中的位置10, 774与位置11，716之间的DNA，或与位于序列IDNO: 1中的位置10, 774 与位置11，716之间的DNA至少95%相同的多核苷酸。6. 如权利要求2所述的表达载体，其中所述5'CHEFl转录调控DNA包含序列IDNO: 2 或与序列IDN0:2至少95%相同的多核苷酸。7. 如权利要求2所述的表达载体，其中所述5'CHEFl转录调控DNA包含位于序列ID NO: 2中的位置1与位置4057之间的DNA，或与位于序列IDNO: 2中的位置1与位置4057 之间的DNA至少95 %相同的多核苷酸。8. 如前述权利要求中任一项所述的表达载体，其还包含3'CHEFl转录调控DNA。9. 如权利要求8所述的表达载体，其中所述3'CHEFl转录调控DNA包含序列IDNO: 3 或与序列IDN0:3至少95%相同的多核苷酸。10. 如权利要求8所述的表达载体，其中所述3'CHEFl转录调控DNA包含位于序列ID NO: 3中的位置1与位置4180之间的DNA，或与位于序列IDNO: 2中的位置1与位置4180 之间的DNA至少95 %相同的多核苷酸。11. 如权利要求10所述的表达载体，其中所述3'CHEFl转录调控DNA包含位于序列ID NO: 3中的位置1与位置209之间的DNA，或与位于序列IDNO: 3中的位置1与位置209之 间的DNA至少95 %相同的多核苷酸。12. 如权利要求8-11中任一项所述的表达载体，其中所述3'CHEFl转录调控DNA包含 约4. 2千碱基。13. 如前述权利要求中任一项所述的表达载体，其包含CMV启动子。14. 如前述权利要求中任一项所述的表达载体，其包含AdTPL序列。15. 如前述权利要求中任一项所述的表达载体，其包含CMV启动子和AdTPL序列。16. 如权利要求2所述的表达载体，其中所述5'CHEFl转录调控DNA包含在序列ID 勵:1中列出的0嫩，其中序列10勵:1中的位置1与位置11，716之间的一个或多个碱基缺 失和代替为CMV启动子和/或AdTPL序列。17. 如权利要求16所述的表达载体，其中序列IDNO: 1中的位置10, 512与位置11，716 之间的一个或多个碱基缺失和代替为CMV启动子和/或AdTPL序列。18. 如权利要求17所述的表达载体，其中序列IDNO: 1中的位置10, 512与位置11，716 之间的一个或多个碱基缺失和代替为CMV启动子。19. 如权利要求17所述的表达载体，其中序列IDNO: 1中的位置10, 512与位置11，716 之间的一个或多个碱基缺失和代替为AdTPL序列。20. 如权利要求17所述的表达载体，其中序列IDNO: 1中的位置10, 512与位置11，716 之间的一个或多个碱基缺失和代替为CMV启动子和AdTPL序列。21. 如前述权利要求中任一项所述的表达载体，其还包含序列IDN0:4或与序列ID NO:4至少95%相同的多核苷酸。22. 如前述权利要求中任一项所述的表达载体，其还包含序列IDN0:5或与序列ID NO: 5至少95 %相同的多核苷酸。23. 如前述权利要求中任一项所述的表达载体，其还包含序列IDN0:6或与序列ID NO:6至少95%相同的多核苷酸。24. 如前述权利要求中任一项所述的表达载体，其还包含序列IDN0:7或与序列ID NO: 7至少95 %相同的多核苷酸。25. 如前述权利要求中任一项所述的表达载体，其还包含选择性标记基因。26. 如前述权利要求中任一项所述的表达载体，其还包含编码目标蛋白质的多核苷酸， 所述目标蛋白质可操作地连接至所述5'CHEFl转录调控DNA、所述3'CHEFl转录调控DNA、 所述CMV启动子和/或所述AdTPL序列。27. -种用如前述权利要求中任一项所述的表达载体转化、转导或转染的宿主细胞。28. 如权利要求27所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是原核细胞。29. 如权利要求27所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是真核细胞。30. 如权利要求29所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是仓鼠细胞。31. 如权利要求30所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是中国仓鼠细胞卵巢（CHO)细 胞。32. 如权利要求29所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是非仓鼠哺乳动物细胞。33. 如权利要求32所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是人细胞。
【专利摘要】本发明提供用于高水平表达重组蛋白的表达载体和宿主细胞。所述表达载体包含中国仓鼠卵巢延长因子1-α(CHEF1)转录调控DNA元件和巨细胞病毒(CMV)启动子和/或人腺病毒三联前导(AdTPL)序列。与以前描述的表达系统相比，本发明实现宿主细胞的增加蛋白表达和更好的产率。
【IPC分类】C12N15/67, C12N15/85
【公开号】CN105209625
【申请号】CN201480014593
【发明人】霍华德·R·克拉可
【申请人】Cmc依科斯生技制品公司
【公开日】2015年12月30日
【申请日】2014年3月11日
【公告号】CA2904125A1, EP2971005A1, US9297024, US20140273208, US20160177335, WO2014164869A1