生产并且 在第3天转移至34°C下。在第3、5、7、10和12天测量活细胞密度、活力百分比以及产率。 图4A示出活细胞密度，其中X-轴上示出天数，并且y-轴上描绘以10e5个细胞每毫升测量 的活细胞密度。图4B示出活力百分比，其中X-轴上示出天数，并且y-轴上描绘细胞活力 百分比。图4C示出产率，其中X-轴上示出天数，并且y-轴上描绘以微克每毫升计的蛋白 质滴定度。
[0021] 图5示出用载体pDEF38-GPl、pDEF85-GPl或pDEF86-GPl转染的CHO宿主细胞的 比产率。X-轴上示出以百万细胞每毫升乘以天数测量的综合细胞面积（ICA)，并且y-轴上 描绘以微克每毫升测量的蛋白质滴定度。比产率值计算为在整个细胞培养期间平均每天每 个细胞的微微克蛋白质。
[0022] 图6示出用在BFl-补充培养基中生长的载体pDEF38-GPl、pDEF85-GPl或 PDEF86-GP1转染的CHO宿主细胞的产率。将复制转染池以12天分批补给生产模式运行，并 且在第4、6、8、10以及12天补给BFl至加入CB的CD-CHMl基础培养基中。在37°C下运行 生产并且在第3天转移至34°C下。在第5、7、10和12天测量滴定度样品。X-轴上示出天 数，并且y-轴上描绘以微克每毫升测量的蛋白质滴定度。
[0023] 图7示出用在BFl-补充培养基中生长的载体pDEF38-MAbl、pDEF85-MAbl或 pDEF86-MAbl转染的CHO宿主细胞的生长和产率。将复制转染池以12天分批补给生产模 式运行，并且在第4、6、8、10以及12天将BFl补给至加入CB的⑶-CHMl基础培养基中。在 37°C下运行生产并且在第5天转移至32. 5°C下。在第7、10、12和14天测量抗体滴定度样 品。图7A示出生长，其中x-轴示出天数，并且y-轴描绘以10e5个细胞每毫升测量的活细 胞密度。图7B示出产率，其中X-轴上示出天数，并且y-轴上描绘以微克每毫升测量的蛋 白质滴定度。
[0024] 图8示出用载体pDEF38-MAbl或pDEF85-MAbl转染的CHO宿主细胞的生长和产 率。在用PDEF38或pDEF85转染后，将表达MAbl的十二个随机选择的克隆以12天分批补 给生产模式运行，并且在第4、6、8、10以及12天将BFl补给至加入CB的⑶-CHMl基础培养 基中。在37°C下运行生产并且在第5天转移至32. 5°C下。在第4、6、11、和13天测量活细 胞密度和抗体滴定度。图8A示出每个克隆的生长，其中X-轴示出天数，并且y-轴描绘以 10e5个细胞每毫升测量的活细胞密度。图8B示出每个克隆的产率，其中X-轴示出天数，并 且y-轴描绘以微克每毫升测量的抗体滴定度。
[0025] 图9示出用载体pDEF38-GPl或pDEF85-GPl转染的CHO宿主细胞的产率。在用 PDEF38-GP1或pDEF85-GPl转染后，使用流式细胞术选择八个表达GPl的克隆并且以12天 分批补给生产模式运行。在第4、6、8、10以及12天在加入CB的⑶-CHMl基础培养基中将 BFl补给所述克隆。在37°C下运行生产并且在第3天转移至32. 5°C下。在第5、7、10、12和 14天测量滴定度。图9A示出用CHEFl载体pDEF38-GPl转染的克隆的产率，其中X-轴示 出天数，并且y-轴描绘以微克每毫升测量的蛋白质滴定度。图9B示出用CHEF1-CMV载体 PDEF85-GP1转染的克隆的产率，其中X-轴示出天数，并且y-轴描绘以微克每毫升测量的蛋 白质滴定度。
【具体实施方式】
[0026] 本公开提供一种表达载体，其包含调控DNA元件的组合以用于实现与本领域已知 载体相比的高水平的蛋白表达和改善的产率，本公开还提供用在此所述的表达载体转化的 宿主细胞。本公开的表达载体包含与CMV启动子和/或AdTPL序列组合的CHEFl转录调控 DNA。之前已经描述使用CHEFl转录调控DNA元件在表达载体中以实现高水平表达重组蛋白 (美国专利第5, 888, 809号；Running Deer和Allison, 2004)。对于许多不同的蛋白质和 宿主细胞类型，来自CHEFl-驱动载体的蛋白表达已经示出明显高于来自CMV启动子控制的 载体的蛋白表达，并且所述增加能够大于250倍（Running Deer和Allison, 2004)。AdTPL 序列是在晚期病毒mRNA上发现的200-核苷酸5'非编码序列，所述mRNA增强它们的翻译 (Logan，PNAS 81:3655 ;1984)〇
[0027] 考虑到使用CHEFl控制载体所获得的改善的蛋白表达，非CHEFl控制区（例如CMV 启动子或AdTPL序列）至CHEFl表达载体的添加是违反直觉的。这种非CHEFl控制区的存 在会破坏个别CHEFl转录调控元件的协同作用并且预计将不会与CHEFl调控DNA -致行 动以产生改善的蛋白表达。然而，本公开的包含CHEFl转录调控DNA和CMV启动子和/或 AdTPL序列的表达载体，与仅包含CHEFl控制区的载体相比，令人惊奇地产生了增加的蛋白 表达。
[0028] 如本文所用，以下定义可用于帮助熟练的技术人员理解本公开：
[0029] 术语"表达载体"是指用于向宿主细胞转移编码信息的任何分子。在各种方面中， 表达载体是核酸、质粒、粘粒、病毒或人工染色体。
[0030] 术语"宿主细胞"是指已经通过携带目标基因的表达载体转化、转染或转导的细 胞，所述目标基因随后通过所述细胞表达。在各种方面中，宿主细胞是原核细胞或真核细 胞。在各种方面中，宿主细胞是细菌细胞、原生生物细胞、真菌细胞、植物细胞，或动物细胞。 所述术语还指亲本宿主细胞的后代，不管后代与父母在基因型或表型方面是否相同，只要 存在目标基因。
[0031] 术语"CMV启动子"是指本领域已知的CMV启动子序列。在各种方面中，CMV启动 子是任何起源，所述起源包括鼠科（mCMV)或人（hCMV)。在各种方面中，hCMV起源于任何 CMV株。在各种方面中，CMV株是AD169、Davis、Toledo或Towne。在本公开的各种实施方 案中，CMV启动子含有在SEQ ID NO:4中列出的多核苷酸。
[0032] 术语"AdTPL序列"是指本领域已知的存在于人腺病毒晚期病毒mRNA中的大约200 个核苷酸，即5'非编码序列。在各种实施方案中，AdTPL序列含有在SEQ ID N0:5中列出 的多核苷酸。
[0033] 术语"CHEF1转录调控DNA"是指含有能够控制CHEFl基因转录的顺式调控元件的 非编码序列，例如启动子区和元件，例如增强子、绝缘子（insulators)以及框架/基质附着 区。
[0034] 术语"5' CHEFl转录调控DNA"是指在自然界中位于中国仓鼠基因组的CHEFl基因 起始密码子的5'端（即上游）的DNA。
[0035] 术语"3' CHEFl转录调控DNA"是指在自然界中位于，中国仓鼠基因组的CHEFl基 因起始密码子的3'端（即下游）的DNA。
[0036] 术语"大约"和"约"是指在参考量的近范围内的量。关于多核苷酸，大约/约指 定长度的序列是在所引述长度的5 %以内。
[0037] 在各种方面中，根据本公开的表达载体包含CHEFl转录调控DNA和CMV启动子和 /或AdTPL序列。在各种方面中，CHEFl转录调控DNA包含5' CHEFl转录调控DNA和/或 3' CHEFl转录调控DNA。
[0038] 在各种实施方案中，5'CHEFl转录调控DNA包含在SEQ ID NO: 1中列出的多核苷 酸。本公开还提供与在SEQ ID N0:1中列出的多核苷酸至少99%、至少98%、至少97%、至 少96%、至少95%、至少94%、至少93%、至少92%、至少91 %、至少90%、至少85%、至少 80 %、至少75 %或至少70 %相同的5' CHEFl转录调控DNA。在各种实施方案中，5' CHEFl转 录调控DNA包含位于SEQ ID NO: 1的位置1与位置11，716之间的DNA，即，SEQ ID NO: 1的一 部分。本公开还提供与位于SEQ ID NO: 1中的位置1与位置11，716之间的DNA至少99%、 至少98%、至少97%、至少96%、至少95%、至少94%、至少93%、至少92%、至少91 %、至 少90 %、至少85 %、至少80 %、至少75 %或至少70 %相同的5' CHEFl转录调控DNA。在各种 方面中，5'CHEFl转录调控DNA包含位于SEQ ID N0:1中的位置10, 744与位置11，716之间 的DNA。本公开还提供与位于SEQ ID NO: 1中的位置10, 744与位置11，716之间的DNA至 少99%、至少98%、至少97%、至少96%、至少95%、至少94%、至少93%、至少92%、至少 91 %、至少90 %、至少85 %、至少80 %、至少75 %或至少70 %相同的5' CHEFl转录调控DNA。 在各种实施方案中，5'CHEFl转录调控DNA包含在SEQ ID NO: 2中列出的多核苷酸。本公 开还提供与在SEQ ID N0:2中列出的多核苷酸至少99%、至少98%、至少97%、至少96%、 至少95%、至少94%、至少93%、至少92%、至少91 %、至少90%、至少85%、至少80%、至 少75%或至少70%相同的5' CHEFl转录调控DNA。在各种实施方案中，5' CHEFl转录调控 DNA包含位于SEQ ID NO: 2的位置1与位置4057之间的DNA，即，SEQ ID NO: 2的一部分。 本公开还提供与位于SEQ ID NO: 2的位置1与位置4057之间的DNA至少99%、至少98%、 至少97%、至少96%、至少95%、至少94%、至少93%、至少92%、至少91 %、至少90%、至 少85%、至少80%、至少75%或至少70%相同的5' CHEFl转录调控DNA。