干细胞体外扩增代数多，可以扩增到60代以上，在体外可以快速扩增。
[0018]3.本发明提供的诱导神经干细胞的方法，诱导分化周期短、转分化效率高。
[0019]4.本发明提供的诱导神经干细胞的方法，可以在没有滋养层细胞的情况下获得神经干细胞，避免外来细胞的污染。
【附图说明】
[0020]为了更清楚地说明本发明【具体实施方式】或现有技术中的技术方案，下面将对【具体实施方式】或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0021]图1将外周血经Ficoll密度梯度离心后中间云雾状的细胞层；
[0022]图2将外周血单个核细胞在体外扩增14天后形态；
[0023]图3转染后10天后神经干细胞；
[0024]图4转染后30天后神经干细胞；
[0025]图5神经干细胞单层平铺培养时形态；
[0026]图6诱导神经干细胞表达神经干细胞蛋白Nestin ；
[0027]图7诱导神经干细胞表达神经干细胞标志Sox2蛋白；
[0028]图8诱导神经干细胞表达神经干细胞标志Soxl蛋白；
[0029]图9诱导神经干细胞具有正常的核型；
[0030]图10诱导神经干细胞分化出成熟神经元；
[0031]图11诱导神经干细胞分化出星形胶质细胞；
[0032]图12诱导神经干细胞分化出TH阳性的多巴胺能神经元；
[0033]图13诱导神经干细胞分化出运动神经元；
[0034]图14诱导神经干细胞分化为少突胶质细胞；
[0035]图15神经电生理检查。
【具体实施方式】
[0036]实施例1
[0037]步骤一:分离血液中单个核细胞。
[0038]1.室温下，成人外周静脉采血5-10ml，储存在含有肝素的抗凝管中，上下颠倒混匀5次。
[0039]2.采用密度梯度离心法收集单个核细胞，具体操作为:将外周血按1:2使用PBS稀释，室温，存放在50ml离心管中，稀释后的血液若不够35ml，则用PBS补齐，使得最终稀释后血液量为35ml。
[0040]3.另取50ml离心管盛15ml Ficoll-Paque Premium,然后倾斜45度，将稀释的血液缓慢流入到盛Ficoll-Paque Premium管中。
[0041]4.25度，离心30分钟，离心速度为750g，离心时，离心机制动需关闭。
[0042]5.离心后在离心管中上层为血浆样物，中间云雾状细胞即为我们所需要的单个核细胞层，如图1所示。
[0043]6.巴斯特管吸去上层，然后使用移液管将中间的云雾状细胞层移至另外50ml离心管中。
[0044]7.在获得的细胞层中加入30mlPBS，350g，4度，离心10分钟，此时离心机制动要打开。
[0045]8.吸去上清，将细胞重悬在25ml PBS中。4度，300g，离心10分钟。
[0046]9.吸去上清，将细胞重悬在25ml PBS中。4度，300g，离心10分钟。(重复第8步)。
[0047]10.去上清，将细胞重悬在5ml PBS中，计数。
[0048]步骤二:扩增血液中单个核细胞。
[0049]1.Day-14将离心所得的单个核细胞以2X 106/ml重悬在单个核细胞培养基中，37度，5% C02，2 天。
[0050]2.Day-1 I收集细胞，离心，200g，去上清，将细胞按I X 10%1重悬在单个核细胞培养基中。孵箱孵育3天。
[0051]3.Day-8收集细胞，离心，200g，去上清，将细胞按I X 106/ml重悬在单个核细胞培养基中。孵箱孵育4天。
[0052]4.Day-4收集细胞，离心，200g，去上清，将细胞按I X 10%1重悬在单个核细胞培养基中，孵箱孵育4天。
[0053]步骤三:转染
[0054]l.Day O收集细胞，计数，离心，去上清，将2 X 16单个核细胞重悬在5mlPBS中，室温，离心5分钟，200g，去上清，如图2所示。
[0055]2.将以上细胞重悬在10ul的人⑶34+细胞转染液。
[0056]3.在以上混合液中加入3种质粒，每种质粒各2ug。
[0057]4.使用LONZA试剂盒中配的移液管将以上混合液转移至电转染杯中。
[0058]5.将电转杯放置在电转仪中，使用T-160程序。
[0059]6.电转程序结束后，使用LONZA试剂盒配的移液管将电转后的悬液移至事先在12孔板的一个孔中放置的2ml单个核细胞培养基中，放置在孵箱中37度，5% C02 2天。
[0060]步骤四:神经干细胞的培养
[0061]1.准备:在6孔板中放入Iml 50ug/ml 小时，之后吸去F1DL,加入5ug/mllaminin lml,孵箱过夜，备用。
[0062]2.将电转染后2天的单个核细胞离心，去上清，可见部分细胞电转后死亡，将细胞重悬在神经干细胞培养基中，以(2-4) X 15/孔接种在6孔板上。隔天换液。在第十天左右，可见干细胞克隆出现如图3所示。继续换液，使其继续扩增。
[0063]3.第20-30天左右，克隆增大，使用移液枪将细胞吹下后转移至TOL-Laminin包被的96孔板中，继续扩增，如图4所示，光镜下诱导神经干细胞具有类似神经干细胞的形态如图5所示。
[0064]4.扩增后，进行进一步鉴定，分化以及后续电生理检查验证。
[0065]实验例I诱导神经干细胞表达神经干细胞标志蛋白
[0066]将诱导神经干细胞按5 X 14接种在多聚赖氨酸与层黏蛋白包被的12mm玻片上，神经干细胞培养基培养48小时后进行染色，具体步骤是1.吸去培养基，使用PBS洗两遍，然后加入4%多聚甲醛固定10分钟。2.吸去多聚甲醛，加入0.3%PBST 1ml，重复3次，每次间隔5分钟。3.加入3%驴血清封闭I小时，室温下。4.1小时后，加入一抗，分别将抗体如Nestin(1:500Mouse BD b1science),Soxl (1:200Goat BD b1science), Sox2 (1:1OOOGoateB1science),按比例加入I %驴血清中，然后孵育细胞，4度，过夜。4.吸去一抗，加入对应的二抗。驴抗鼠FITC按1:200对应Nestin，驴抗山羊cy3按1:400对应Soxl，Sox2。室温，避光放置2小时。5.吸去二抗，PBS洗三遍，避光.然后。然后加入DAPI (1:lOOOSigma-Aldrich)，孵育10分钟。6.封片，激光共聚焦拍照，所见干细胞表达Nestin，S0X1，S0X2蛋白，如图6、7、8所示。将处于增殖期的诱导神经干细胞进行裂解，核型分析所示，诱导神经干细胞具有正常核型，如图9所示。
[0067]实验例2神经干细胞分化为成熟的神经元。
[0068]将神经干细胞以2X 14接种在多聚赖氨酸与层黏蛋白包被的12mm玻片上，神经干细胞培养基培养24小时后，将培养基更换为神经元分化培养基，其成分为DMEM:F12，I %N2，I % B27，1%谷胺酰胺 Glutamine，1%非必须氨基酸 NEAA (Life Technologies)，隔天换液，6周后将细胞固定，免疫细胞化学染色。具体为MAP2(1:200 Mouse Sigma)，Neun (1:400Rabbit Millpore)，GFAP (1:500 Rabbit Dako)，如图 10、图 11 所不。所不诱导神经干细胞能分化出成熟神经元，表达成熟神经元蛋白Map2Neun,诱导神经干细胞能分化出星形胶质细胞，表达GFAP。
[0069]实验例3神经干细胞分化为多巴胺能神经元
[0070]将神经干细胞以2X104接种在多聚赖氨酸与层黏蛋白包被的12mm玻片上，神经干细胞培养基培养24小时后，将培养基更换为神经元分化基础培养基，其成分为DMEM:F12,1% N2,l% B27，1%谷氨酰胺Glutamine，I %非必须氨