一种防治水稻纹枯病的菌株1ln2及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于农作物防治技术领域，具体涉及一种防治水稻纹枯病的菌株1LN2及 其应用，专用于水稻纹枯病的绿色防治。
【背景技术】
[0002] 水稻纹枯病是由立枯丝核菌[Rhizoctonia solani]引起的一种土传病害，是水稻 的三大病害之一，分布在世界各个稻区，一般可造成10% -30%的产量损失，发生严重时可 造成产量损失达50%以上。近年来，随着矮杆品种和杂交水稻的大面积推广及栽培措施的 变革，水稻纹枯病发生的面积逐年扩大，给水稻的增产稳产带来了极大的障碍。
[0003] 目前，水稻纹枯病的防治在抗病育种方面尚未突破，至今没有发现免疫或高抗品 种，在实际生产过程中，主要依靠选用耐病品种以及化学药剂来防治，如：井闪霉素、丙环 唑、烯唑醇、恶毒灵、爱苗、满穗、稻立峰等，化学药剂的长期反复使用易产生抗药性，导致使 用量的不断增加以及生产成本的不断提高，在污染环境的同时也存在农药高残留的问题， 给农产品的出口带来障碍，给人畜的生命带来了威胁。因此，采用生物防治策略来防治水稻 纹枯病日益受到关注，成为了这种病害研究的新方向。
[0004] 近年来，生物防治方法防治水稻纹枯病也日益兴盛，主要有：微生物、植物提取物、 稻鸭共养模式等，它们的生防机理主要是通过拮抗、竞争、寄生、抗生以及诱导抗病性等方 面进行病害的防治；已有大量研究报道了将生防菌引入植物可提高植物的抗病、抗逆性。由 于生防菌在抑制植物病害方面的广谱性、高效性以及安全性，目前成为农药市场发展的趋 势，被称为是最有潜力的发展方向。
[0005] 迄今为止尚未发现理想的免疫或高抗品种，主要依赖化学药剂防治，环境污染问 题日益突出，所以在注重发展无绿色生产技术的今天，生物防治作为防治水稻纹枯病的一 种新思路，将得到进一步的重视与发展。因此，开发新的、更为高效和安全的微生物制剂控 制水稻纹枯病的发生是提高社会生产总量的需要，同时更是国家粮食安全及可持续发展战 略的需要。
【发明内容】
[0006] 发明目的：针对水稻纹枯病没有较高防效的生防菌株制剂现状，本发明的第一个 目的是提供一种具有良好的防治水稻纹枯病的生防菌株。
[0007] 本发明的第二个目的是提供防治水稻纹枯病的菌株1LN2在防治大田水稻纹枯病 方面的应用。
[0008] 本发明的第三个目的是提供生防菌剂，专用于防治水稻纹枯病，菌株的防效高，并 且有较好的增产功能。
[0009] 本发明的第四个目的是提供上述生防菌剂的制备方法。
[0010] 本发明的第五个目的是提供上述的生防菌剂在防治水稻纹枯病方面的应用。
[0011] 技术方案：为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：一种防治水稻 纹枯病的菌株1LN2,其分类命名为假单胞菌属（Pseudomonas sp.)，该菌株已于2015年9 月10号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰 西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏编号为CGMCC No. 11361。
[0012] 上述的防治水稻纹枯病的菌株1LN2在防治大田水稻纹枯病方面的应用。
[0013] -种生防菌剂，上述的生防菌剂是由防治水稻纹枯病的菌株1LN2制备而成。
[0014] 上述的生防菌剂的制备方法，包括以下步骤：将菌株1LN2在LB平板上划线，28°C 生化培养箱中培养14_16h，待长出单菌落后，挑取单菌落接入含有5mL的LB培养液的试管 中，置于28°C、200r/min的摇床中培养，制成种子液；以1%的接种量将种子液接种于装有 500mL的LB培养液的三角瓶里，置于28°C、200r/min的摇床中培养48h，待菌液浓度达到 109CFU/mL时稀释待用，即为所制备的1LN2生防菌剂。
[0015] 上述的生防菌剂在防治水稻纹枯病方面的应用。
[0016] 其应用方法为，菌株制剂在作物育苗时喷施于秧盘或与育秧基质混合、也可以稀 释后在大田喷雾使用。
[0017] 有益效果：本发明与现有水稻纹枯病防治技术相比，其优点和积极效果表现在： 本发明是专门针对水稻纹枯病开发的生防菌株，因而在防治水稻纹枯病方面与目前其他化 学药剂相比防治效果显著提高。由于是生防微生物制剂，完全没有因化学农药的使用而带 来环境问题及食品完全问题，因而有利于作物的无公害生产，农民可以不用或减少其他防 治水稻纹枯病化学农药的用量，这不仅可为农民节省开支，而且有利于作物的出口。同时， 生防菌株制剂还有增产功能，可为农民增加收入。
[0018] 1LN2菌株制剂可以在水稻育苗时与基质混合或在水稻流水线播种时随底水喷施 于秧盘内，然后随水稻移栽到大田，同时在大田进行喷雾防治。
[0019] 栽苗后，菌株通过多种生防机制起作用，从而达到防治水稻纹枯病的效果。试验 表明，在温室中使用1LN2菌株制剂对水稻纹枯病有一定程度的防治效果，温室防效达到 60. 25%，处理一个月后田间防效达到50. 31%，1LN2菌株制剂可以提高稻米的蛋白质含 量、降低直链淀粉含量、提高胶稠度，还有一定程度的增产效果，与常规化学药剂相比其增 产效果达到7. 1%。
【附图说明】
[0020] 图1为温室试验中生防菌剂1LN2处理后30天后对水稻秧苗的促生效果；
[0021] 注：左一 CK，右一 1LN2。
【具体实施方式】
[0022] 下面通过具体的实施例对本发明进一步说明，应当指出，对于本领域的普通技术 人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干变型和改进，这些也应视为属于 本发明的保护范围。
[0023] 实施例1菌株的筛选与鉴定
[0024] 于2011年10月，在江苏省太仓市城厢镇东林村以及科教新城发病严重的地块采 集样品。采用五点采样法，每点间隔至少l〇m。每点三株健康植株与发病重的植株连同根围 土一并收集。采集后的样品迅速装入写好编号的塑料袋中带回实验室进行分离。
[0025] 菌株1LN2是从发病的植株茎内分离得到。其分离方法为：分别剪去根茎叶各3g， 用1 %的次氯酸钠 lmL浸5min，70%酒精浸2min，无菌水清洗3次。（取最后一次清洗的溶 液0. lmL涂R2A平板，或取0. lmL最后一次清洗液加入R2A培养液，30°C振荡培养，若48h 后无菌生长则认为表面消毒干净）。用灭菌的研砵分别研碎表面消毒好的根茎叶，加 3mL无 菌水，无菌棉布过滤，用无菌水稀释10倍，取0. lmL涂LB平板，每个点重复3次，28°C培养 48h，计数，挑取平板上所有的菌落分离纯化，-70°C、40%甘油保存备用。
[0026] 通过形态特征，生理生化实验和16S rDNA基因序列分析对该菌株进行鉴定。16S rDNA基因扩增和序列分析：
[0027] 菌株1LN2在R2A培养基中28°C培养至对数期，以12000r/min离心5min收集菌 体，采用上海赛百盛基因技术有限公司的基因组DNA快速提取试剂盒，提取细菌的基因组 DNA，以提取的DNA产物为模板，用细菌16SrDNA基因扩增通用引物U8-27(F)5'-AGAGTTTGA TC (AC) TGGCTCAG-3' ；L1494-1514 (R) 5' -CTACGG (AG) TACCTTGTTACGAC-3'。从细菌的基因组 DNA中扩增出16S rDNA基因片段。PCR产物送上海生工生物工程有限公司进行测序。通 过BLAST软件对测定16S rDNA基因序列进行同源性比较，结果将该菌株鉴定为假单胞菌属 (Pseudomonas sp.)，菌株测序结果如下所示。
[0028] 测序结果：
[0029] 1. GGCTACCATGCAGTCGAGCGGTAGAGAGAAGCTTGCTTCTCTTGAGAGCGGCGGACGGGTGAGTAAT GCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGATAACGTTCGGAAACGGACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAG CAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAG GCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGC AGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGT AAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGTTGTAGATTAATACTCTGCAATTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGG CTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTA GGTGGTTTGTTAAGTTGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCAAAACTGACTGACTAGAGTATG GTAGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCA CCTGGACTAATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTA AACGATGTCAACTAGCCGTTGGAAGCCTTGAGCTTTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGGGGAGT ACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGC AACGCGAAGAACCTTACCAGGCCTTGACATCAAATGAACTTTCTAGAGATAGATTGGTGCCTTCGGGAACATGAGAC AAGGTGCTGCATGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCGTACGAGCGCAACTCTATGTCTAGT ACCAGCACGTCATGGTGGCACTCTAGAACTGCGGTGACAAATCGAGGAGTGGGATGACGTCAGTCATCATGTCTACC GCTGGCTAACCACGTGCTACAATGGTTCGTTACGAGGCTGCCAGCTCGCGAAGGGTGGAGCTC
[0030] 2. AGCTCAACCGTGGTACCGTCCTCCCGAAGGTTAGACTAGCTACTTCTGGTGCAACCCACTCCCATGG TGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGACATTCTGATTCGCGATTACTAGCGATTCCGAC TTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGGACTACGATCGGTTTTATGGGATTAGCTCCACCTCGCGGCTTGGCA ACCCTCTGTACCGACCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGCCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCT TCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCCTTAGAGTGCCCACCATGACGTGCTGGTAACTAAGGACAAGGGTTGCGCTC GTTACGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTCTCAATGTTCCCGAAGG CACCAATCTATCTCTAGAAAGTTCATTGGATGTCAAGGCCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACA T