玉米胚乳特异表达启动子pmap启动子、其克隆方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种玉米胚乳特异表达启动子PMAP启动子、其克隆方法及其应用。
技术背景
[0002]启动子是一段位于基因上游区的DNA序列，参与下游基因的表达调控，决定了基因的转录起始、转录效率和时空特异性。启动子并不直接控制基因的表达，而是通过与转录因子结合来控制基因的转录。按照启动子的作用方式和功能可以分为三大类:组成型启动子、诱导型启动子以及组织特异性启动子。
[0003]玉米(Zea mays L.)是重要的粮食作物、优良的饲料和工业原料。因此，大量研究致力于将外源基因转入玉米以培育出满足人们需求的新品种。现今的转基因技术通常采用组成型强启动子驱动外源基因高效表达。但全组织表达的调控模式可能会打破原有的作物特性，引发代谢失衡从而对作物产生毒性。
[0004]组织特异性启动子的引入可以弥补组成型启动子的缺陷。组织特异性启动子在植物发育过程中能够在时间和空间上有效地调控目的基因的特异性表达，使目的基因表达产物在特定的空间区域积累，进而按照人们的意愿改进代谢途径、提高组织中营养物质含量、调控转基因植物继代繁殖、利用种子便利地获得工业新产品和医药新化合物等，同时减轻植物代谢负担，更加有效的利用植物营养分配。组织特异性启动子已成为转基因研究中具有较好发展潜力的外源基因表达开关。
[0005]目前对于组织特异性启动子的应用主要有以下方面:①改良农作物品质，提高作物的抗冻、抗旱、抗盐能力，防止水果腐烂；?改良花卉品质、控制观赏花卉的颜色?’③提高植物的抗病性、抗虫性和抗除草剂能力；④开发生物反应器用于生物制药；?创建雄性不育系和恢复系；⑥用于植物的分化发育研究等。
[0006]胚乳作为玉米重要的营养贮藏器官，直接决定了米品质优劣。因此，胚乳特异性启动子作为一种重要的顺式作用元件，具有重要的应用价值，今后在利用转基因技术来提高种子中蛋白质含量和制备植物生物反应器等方面，将会有更加广泛的应用。
[0007]本发明通过生物信息学方法筛选出1个玉米胚乳特异性启动子。通过分析这个启动子可为玉米遗传转化实验提供具有价值的分子工具。
【发明内容】
[0008]本发明的目的之一在于提供玉米胚乳中特异表达启动子PMAP启动子序列。
[0009]本发明的目的之二在于提供该启动子的克隆方法。
[0010]本发明的目的之三在于提供在调控玉米胚乳中下游基因特异表达中的应用。
[0011 ] 为了实现本发明目的，本发明采用如下技术方案:
一种玉米胚乳中特异表达启动子PMAP启动子序列，其特征在于该启动子序列具有下列序列之一: i)SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列；
ii)SEQID N0.1所示的核苷酸序列在保留核心启动子序列的基础上经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸且具有同等功能的由i)衍生的核苷酸序列。
[0012]一种载体，其特征在于该载体含有上述的玉米胚乳中特异表达启动子PMAP启动子序列。
[0013]一种转基因细胞系，其特征在于该细胞系含有上述的玉米胚乳中特异表达启动子PMAP启动子序列。
[0014]一种工程菌，其特征在于该工程菌含有上述的玉米胚乳中特异表达启动子PMAP启动子序列。
[0015]一种克隆上述的玉米胚乳中特异表达启动子PMAP启动子序列，其特征在于该方法的具体步骤为:玉米胚乳特异表达基因PMAP的ATG上游序列，截取2000bp的碱基序列，设计引物，以B73基因组为模板，通过PCR扩增技术获得玉米胚乳中特异表达启动子PMAP启动子序列；所述的扩增片段的引物序列:
正向引物从5丨端至3丨端为:AAATAGTAGCTAGCTCACCC ；
反向引物从5'端至3'端为:TATATATTGCCCCCTCTCTC。
[0016]6.一种根据权利要求1所述的玉米胚乳中特异表达启动子PMAP启动子序列在调控下游基因在玉米胚乳中的特异性表达的应用。。
[0017]一种上述的玉米胚乳特异表达启动子NRP1启动子在调控下游基因在玉米胚乳中的特异性表达的应用。将玉米PMAP基因的起始密码子(ATG)上游2kb序列扩增后，连接到⑶S表达载体pTF102上，将构建好的载体转化玉米，获得转基因株系，并用⑶S显示底物x-gluc对转基因植株染色，观察胚乳的着色情况。
[0018]本发明首次提出一个新的能够在玉米胚乳中特异表达的PMAP启动子，该启动子适用于启动目标基因(如GUS基因或GFP基因)在玉米胚乳中的特异性表达。该启动子的特异性很强，因此为植物基因工程表达载体的构建提供了合适的调控元件，也为实验室其他课题的研究进行提供了新的材料。
【附图说明】
[0019]图1玉米胚乳特异表达启动子PMAP及其缺失片段的⑶S瞬时表达载体构建方案图。
[0020]图2 2kb PMAP启动子片段及其lkb和500bp缺失片段的⑶S瞬时表达载体分段酶切鉴定图。
[0021 ] 图3 pUC-pPMAP-GUS载体构建示意图。
[0022]图4 B73玉米授粉后14天籽粒基因枪轰击⑶S染色结果。
[0023]+:35S (正对照)-:B73 负对照 A:PMAP-2000bp 片段 B:PMAP-1000bp 片段 C:PMAP-500bp片段图中的标尺长度代表1_
图5 pTF102-pPMAP-GUS玉米转化载体构建示意图。
[0024]图6 PBPA玉米幼胚转化流程图。
[0025]A:取胚侵染B:共培养C:恢复培养D: 一轮筛选E:三轮筛选F:抗性愈伤 G:暗再生Η:光再生1:阳性苗入土图7 PCR检测转基因阳性结果电泳图。
[0026]A: (bar) B: (GUS)
M:DNA 分子量 Marker ；1:PMAP-12-1 阴性；2:PMAP-12-2 阳性；3:PMAP-12-3 阴性；4:PMAP-12-4 阳性；5:PMAP-12-5 阳性；6:PMAP-12-6 阳性；7:PMAP-12-7 阳性；8:PMAP-12-8阴性；9:PMAP-12-9 阳性；10:PMAP-12-10 阴性；11:PMAP-12-11 阴性；12:PMAP-12-12 阴性；13:PMAP-12-13 阳性；14:PMAP-12-14 阴性；15:PMAP-12-15 阳性；16:PMAP-12-16 阳性；17:PMAP-12-17 阴性；18:PMAP-12-18 阳性；负对照:PBPA ;水对照。
[0027]图8转基因植株的叶、根、种皮、胚、胚乳组织的⑶S染色结果图 35S-GUS 的
a:根b:叶c:种皮d:胚e:胚乳 PMAP-GUS 的
A:叶B:根C:种皮D:胚E:胚乳图中的标尺长度代表1_。
【具体实施方式】
[0028]下面结合具体实施事例，进一步阐述本发明。应理解，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，如分子克隆(Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 3rd ed.)