或植物分子生物学一实验手册(Plant Molecular B1logy — A Laboratory Manual, Melody S.Clark编，Springer-verlag Berlin Heidelberg, 1997)中所述条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0029]实施例一:获得启动子片段
在NCBI数据库中找到玉米胚乳特异表达基因PMAP的ATG上游序列，截取2000bp的碱基序列，具体序列详见SEQ ID N0.1，设计引物，以B73基因组为模板，通过PCR扩增技术获得片段，参见图1。扩增片段的引物序列:
正向引物从5丨端至3丨端为:AAATAGTAGCTAGCTCACCC ；
反向引物从5'端至3'端为:TATATATTGCCCCCTCTCTC ；
结果:获得2000bp目的片段后通过ΤΑ克隆连接载体，酶切鉴定(见图2)，测序比对，与数据库中提供的序列一致。
[0030]实施例二:启动子截短片段的获得
根据预测启动子元件的网站(http://www.softberry.com)的预测结果，分别截取1000bp、500bp大小的碱基序列，PCR获得片段。扩增片段的引物序列:
1000bp:
正向引物从5'端至3'端为:TAGATGCTCATACTCTAGTA ；
反向引物从5'端至3'端为:TATATATTGCCCCCTCTCTC ；
500bp:
正向引物从5'端至3'端为:TCGCGCGCGCGTGACAAACC ；
反向引物从5'端至3'端为:TATATATTGCCCCCTCTCTC ；
结果:分别回收不同大小的目的片段后通过TA克隆连接载体，酶切鉴定(见图2)，测序比对，与提供的序列一致。
[0031]实施例三:截短片段与⑶S基因连接，打基因枪，验证启动子核心元件
用ZAa I + Hind III酶点将gusA-NOS片段从pBI121载体(见图3)上酶切连接到pUC19载体(见图3)中，构建pUC19-GUS-noS载体。将克隆到的不同长度的片段回收连接测序验证正确后，用Xba l+BamH I酶切，连入pUC19-Gus_nos，构建pUC19-pPMAP_GUS载体。将构好的载体转入大肠杆菌T0P10中，抽提质粒后打基因枪。
[0032]选取B73玉米授粉后14天的籽粒为受体材料，用70%酒精消毒剥去种皮，放到渗透培养基上培养6小时后进行基因枪的瞬时转化。基因枪的轰击参数:压力650，距离3cm，两枪。轰击之后25°C暗培养48小时，⑶S染色(见图4)。
[0033]结果:PMAP-2000bp启动子片段、lOOObp片段、500bp片段均有⑶S表达，说明截短到500bp片段时启动子仍有功能。
[0034]实施例四:根据截短片段的功能验证结果，选取2000bp片段构建表达载体，农杆菌转化玉米幼胚
选取pTF102载体作为农杆菌转化玉米幼胚的载体。先用I酶切PTF102载体去除35S-GUS片段，载体自连。将pUC19-pPMAP-GUS载体中的2000bp启动子片段连接⑶S的区段用Ι+EcoRl酶切后，连入自连后的pTF102载体，构建pTF102-pPMAP-GUS载体(见图5)，电击转化EHA105菌株。
[0035]选取PBPA玉米品系授粉8-12天的幼胚，大小约1.5mm左右作为受体材料，进行幼胚转化，具体流程(见图6):农杆菌侵染lOmin-共培养20°C 3天-恢复培养28°C 7天-筛选培养(双丙氨磷1.5mg/l)28°C 14天-筛选培养(双丙氨磷3mg/l)28°C 14天3-5轮-获得抗性愈伤组织-暗再生培养28°C 14-21天-光再生培养28°C 14-21天-获得阳性苗-移入盆中-PCR检测阳性植株(图7)-授粉获得后代。
[0036]结果:选取约2000个幼胚作为受体材料，经过转化筛选后获得10个抗性愈伤，经过再生后获得转基因植株，并收获后代。同时选取部分事件的叶子抽提基因组，通过标记基因bar和目的基因⑶S的双重PCR检测转基因阳性结果。
[0037]实施实例五:⑶S染色
选取35S-GUS作为正对照，对转基因植株的根、叶、种皮、胚、胚乳分别进行⑶S染色，验证启动子的特异性(见图8)。
[0038]结果:35S_GUS在玉米植株的根、叶、胚、胚乳均有⑶S基因表达，而pPMAP-GUS在玉米植株的根、叶、种皮、胚组织均没有⑶S基因表达，只有胚乳组织中⑶S基因高效表达，证明PMAP启动子的特异性很好。
【主权项】
1.一种玉米胚乳中特异表达启动子PMAP启动子序列，其特征在于该启动子序列具有下列序列之一: i)SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列； ii)SEQID N0.1所示的核苷酸序列在保留核心启动子序列的基础上经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸且具有同等功能的由i)衍生的核苷酸序列。2.一种载体，其特征在于该载体含有根据权利要求1所述的玉米胚乳中特异表达启动子PMAP启动子序列。3.一种转基因细胞系，其特征在于该细胞系含有根据权利要求1所述的玉米胚乳中特异表达启动子PMAP启动子序列。4.一种工程菌，其特征在于该工程菌含有根据权利要求1所述的玉米胚乳中特异表达启动子PMAP启动子序列。5.一种克隆根据权利要求1所述的玉米胚乳中特异表达启动子PMAP启动子序列，其特征在于该方法的具体步骤为:玉米胚乳特异表达基因PMAP的ATG上游序列，截取2000bp的碱基序列，设计引物，以B73基因组为模板，通过PCR扩增技术获得玉米胚乳中特异表达启动子PMAP启动子序列；所述的扩增片段的引物序列: 正向引物从5丨端至3丨端为:AAATAGTAGCTAGCTCACCC ； 反向引物从5'端至3'端为:TATATATTGCCCCCTCTCTC。6.一种根据权利要求1所述的玉米胚乳中特异表达启动子PMAP启动子序列在调控下游基因在玉米胚乳中的特异性表达的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种玉米胚乳特异表达启动子PMAP启动子、其克隆方法及其应用。本发明首次分离到一个可在玉米胚乳中特异性表达的启动子——plasma？membrane？associated？protein？(PMAP)启动子。该启动子具有SEQ？ID？NO.1所示的核苷酸序列，或该序列经取代、缺失和／或添加一个或几个核苷酸且具有同等功能的由其衍生的核苷酸序列。本发明从克隆玉米胚乳特异表达启动子PMAP启动子入手，通过对PMAP启动子的功能分析，从实验水平验证了该启动子适用于启动目标基因在玉米胚乳中特异性表达，而在其他组织中低表达或不表达。为植物基因工程表达载体构建提供了合适的调控元件，为实验室其他课题的研究进行提供了新的材料。
【IPC分类】C12N15/113, C12N15/82, C12N1/21, C12N15/10
【公开号】CN105316338
【申请号】CN201510826510
【发明人】宋任涛, 张伟, 田忠瑞, 祁巍巍, 梅冰, 唐远平
【申请人】上海大学
【公开日】2016年2月10日
【申请日】2015年11月25日