可被检测的蛋白质、核酸或其他实体，例如通过将放射性标记物掺入至与靶分子特异性反应的抗体、肽或寡核苷酸中。可以采用本领域已知的用于使寡核苷酸偶联所述标记物的任何方法，例如，使用如下文献中所述的方法:Hermanson，《生物偶联技术》(B1conjugate Techniques) 1996，圣迭戈的学术出版社有限公司(Academic Press,Inc.) ο
[0031]“连接”至标记物的分子(例如本文所述经标记探针)是共价(通过接头或化学键)或非共价(通过离子、范德华力、静电或氢键)地结合标记物的分子，从而可通过检测与该分子结合的标记物来检测是否存在该分子。
[0032]“嵌入染料”指嵌入双链核酸(如双链DNA)的分子。在一些实施方式中，嵌入染料发荧光。在一些情况中，与在溶液中游离时的荧光相比，嵌入染料在结合核酸时的荧光增加。多种嵌入染料是本领域已知的。一些非限制性示例包括:9_氨基吖啶、溴化乙啶、菲啶染料、EvaGreen^PICO GREEN(P_7581，分子探针公司(Molecular Probes))、EB(E_8751，西格玛公司(Sigma))、碘化丙啶(P-4170，西格玛公司)、吖啶橙(A-6014，西格玛公司)、噻唑橙、噁唑黄、7-氨基放线菌素D(A-1310，分子探针公司)、花青染料(如Τ0Τ0、Υ0Υ0、Β0Β0和Ρ0Ρ0)、SYTO^SYBR Green I (美国专利号5,436，134:N’，N’_二甲基-N_[4_[ (E)-(3_甲基-1，3_苯并噻唑-2-亚基)甲基]-1-苯基喹啉-1-鑰-2-基]-N-丙基丙烷-1，3-二胺)、SYBR Green II(美国专利号5，658，751)、SYBR DX、01iGreen、CyQuant GR^SYTOX Green、SYT09、SYT010、SYT017、SYBR14、FUN-1、DEAD Red、碘化己啶、溴化乙啶、二氢乙啶、溴乙啡锭二聚体、9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶、DAP1、DIP1、吲哚染料、咪唑染料、放线菌素D、羟芪巴脒、LDS 751(美国专利号6,210,885)，以及以下文献中描述的染料:Georgh1u,Photochemistry andPhotob1logy (《光化学和光生物学》)，26: 59-68，培格曼出版公司(Pergamon Press)(1977);Kubota等，B1phys.Chem.,6: 279-284( 1977);Genest等，Nuc.Ac.Res., 13: 2603-2615(1985) ；Asseline,EMBO J.,3:795-800(1984) !Richardson等，美国专利号4,257,774;以及Letsinger等，美国专利号4，547，569。
[0033]uSybr Green I” 指N’，N’-二甲基-N_[4_[ (E)-(3_甲基-1，3_苯并噻唑-2-亚基)甲基]-1-苯基陸琳-1-鐵-2-基]-N-丙基丙烧-1,3_二胺。
[0034]发明详述
[0035]引言
[0036]核苷酸序列的分子检测通常受限于试验的特异性。例如，检测试剂可结合靶核苷酸且还与非靶核苷酸交叉反应。这类交叉反应性代表同时差分检测两种核酸期间的困难。此外，当一种感兴趣的核酸在序列上非常类似于另一种感兴趣的核酸时，难以避免交叉反应性。
[0037]其中样品被划分为一组小混合物划分产物并随后检测核苷酸的数字方法还可与交叉反应的检测试剂混淆。此外，当一种感兴趣的核酸是常见的且浓度显著高于待检测的另一种稀有核苷酸(例如高2、3、4、5、6、7、10、15、20、25、30、50、100、200、400、500、1000、10000倍或更高)时，难以区分同时含有常见和稀有核苷酸的划分产物与仅含有常见核苷酸的划分产物。例如，为确保适当数目的含有稀有核苷酸的划分产物，可以每个划分产物高浓度的核苷酸样品加载各划分产物。所得划分产物中许多可含有高浓度的常见序列且很少或没有核苷酸含有稀有序列。
[0038]在一些情况中，检测试剂的交叉反应性和/或两种靶核苷酸浓度的巨大差异可导致对应于常见序列的一个检测通道中的强信号和对应于稀有序列的第二检测通道中的弱信号。此外，同时含有常见(如野生型)序列和稀有序列的划分产物簇(++)可扩散到接触仅常见(如野生型)划分产物(+_)的扩散云(diffuse cloud)。这可导致难以区分仅含有常见序列的划分产物与同时含有常见和稀有序列的划分产物(如图1所示)。具体而言，在图1中箭头附近聚集的划分产物难以明确地归类为++或+_。
[0039]包括划分步骤的用于同时检测或定量多种感兴趣的核酸的方法可通过使用一种序列特异性检测试剂和一种非特异性检测试剂测试划分产物来改进。这类方法可提供测量各划分产物中是否存在对应于序列特异性检测试剂的靶核酸和各划分产物中是否存在总核酸(如总核酸、总扩增的核酸、总逆转录的核酸、总DNA或总双链核酸)的能力，如图2所示。含靶核酸的划分产物数目可对应于含稀有物质(如突变、序列变体或多态性)的划分产物数目。此外，含有总核酸的划分产物数目可对应于含有稀有物质的划分产物数目加含有常见物质的划分产物数目(例如含有具有突变序列的核酸、野生型核酸或上述两者的划分产物数目)。在一些实施方式中，可随后通过将其中序列特异性检测试剂检测到存在靶核酸的划分产物数目除以其中非特异性检测试剂检测到存在核酸的划分产物数目来计算稀有物质的相对比例。
[0040]例如，在使用检测稀有序列变体的序列特异性检测试剂和检测总核酸的非特异性检测试剂(如嵌入染料)对液滴进行数字检测后，含有稀有变体的液滴百分比可计算为
=[v]/([wt] + [v])。在该情况中，V表示序列变体(例如突变或多态性，如单核苷酸多态性(SNP))，wt表示野生型，且括号对应于浓度或含有括号中物质的液体相对数目。例如，[V]可对应于其中序列特异性检测试剂检测到变体的液滴数目，且([wt] + [v])可对应于其中非特异性检测试剂检测到核酸的液滴数目。
[0041]在一些实施方式中，本发明提供了用于定量稀有核酸的相对比例的方法、组合物和试剂盒。这类方法、组合物和试剂盒可用于诊断疾病或确定靶细胞(如癌细胞)的丰度。
[0042]组合物
[0043]样品
[0044]本文所述的方法和组合物可用于检测任何类型样品中的核酸。在一些实施方式中，该样品是生物样品。生物样品可获自任何生物体，例如动物、植物、真菌、细菌或任何其他生物体。在一些实施方式中，该生物样品来自动物，例如哺乳动物(如人或非人灵长类动物、奶牛、马、猪、绵羊、猫、狗、小鼠或大鼠)、鸟(如鸡)或鱼。生物样品可以是获自生物体的任何组织或体液，例如血液，血液成分或血液产品(如血清、血浆、血小板、血红细胞等)，痰液或唾液，组织(如肾、肺、肝、心、脑、神经组织、甲状腺、眼、骨骼肌、软骨或骨组织)；培养的细胞，例如原代培养物、外植体、转化的细胞、干细胞、粪便、尿液等。
[0045]该样品可含有核酸。在一些实施方式中，该样品含有待使用序列特异性检测试剂检测的靶核酸。在一些情况中，该样品不含有待使用序列特异性检测试剂检测的靶核酸。在一些情况中，该样品可能含有待使用序列特异性检测试剂检测的靶核酸。在一些情况中，该样品含有靶核酸和非靶核酸的混合物。
[0046]可制备样品以改进靶核酸和/或总核酸的高效鉴定。例如，可对样品进行纯化、分段、分级、匀化或超声。在一些实施方式中，可从样品(如生物样品)中提取或分离核酸或含有核酸的子组分。在一些实施方式中，针对存在的一种或多种核酸或靶核酸富集该样品。在一些实施方式中，通过亲和方法(如免疫亲和富集)或通过杂交在样品中富集核酸或靶核酸。例如，可通过免疫亲和、离心或本领域已知的其他方法来针对靶核酸富集样品。
[0047]在一些实施方式中，使用尺寸选择(如除去非常小的片段或分子或非常长的片段或分子)在样品中富集靶核酸。在其他实施方式中，通过选择真核信使RNA的聚A尾来富集样品中的RNA分子。例如，可使该样品通过寡dT柱，并可洗脱富聚A RNA以用于进一步分析。
[0048]序列特异性检测试剂
[0049]适用于根据本文所述的方法的序列特异性检测试剂是与感兴趣的核酸特异性相互作用或特异性结合感兴趣的核酸的任何分子。同样地，本发明的序列特异性检测试剂可用于检测是否存在其结合的核酸序列。在一些情况中，该序列特异性检测试剂可区分相差例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸的核酸。
[0050]例如，在一些情况中，序列特异性检测试剂可用于检测靶核酸序列且不或基本不检测或与相差例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸的核酸交叉反应。在一些实施方式中，该序列特异性检测试剂可特异性结合或检测序列变体、突变或多态性。在一些情况中，该序列特异性检测试剂可结合或检测稀有序列。例如，在一些情况中，该序列特异性检测试剂结合或检测稀有核酸序列变体，所述稀有核酸序列变体在样品中的含量为少于含有野生型序列的划分产物的约10%、5%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%、0.005%、0.001%、0.0005%、0.00001%或更少。例如，在一些情况中，该序列特异性检测试剂结合或检测稀有核酸序列变体，所述稀有核酸序列变体在样品中的含量为少于含有野生型序列的划分产物的约10%、5%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%、0.005%、0.001%、0.0005%、0.00001 %或更少，但其基本不结合或检测野生型序列。
[0051 ]在一些实施方式中，该样品在划分样品前与序列特异性检测试剂孵育。在一些实施方式中，该样品在划分样品后与序列特异性检测试剂孵育。在一些实施方式中，该序列特异性检测试剂存在于混合物中。含有序列特异性检测试剂的混合物可包含一种或多种缓冲剂(如水性缓冲剂)、一种或多种添加剂(例如封闭剂或生物防腐剂)、一种或多种扩增试剂(例如核苷酸、引物或聚合酶)，或一种或多种非特异性检测试剂。
[0052]在一些实施方式中，两种或更多种序列特异性检测试剂可特异性结合同一靶标(如果存在)(例如在同一靶标的不同位置或序列处)。例如，两种或更多种序列特异性检测试剂各自可结合同一基因的不同区域。在一些实施方式中，两种或更多种序列特异性检测试剂设计为特异性结合不同的靶核酸(如果存在)。例如，一种序列特异性检测试剂可结合或检测基因或其他感兴趣的核苷酸序列(如序列变体、突变或多态性)且另一序列特异性检测试剂可结合野生型序列或对照序列。在一些实施方式中，该样品在适用于两种或更多种序列特异性检测试剂特异性结合一种或多种靶标的条件下与两种或更多种序列特异性检测试剂孵育(例如在具有两种或更多种序列特异性检测试剂的混合物中)，从而结合一种或多种靶核酸。
[0053]在一些实施方式中，2、3、4、5或更多种序列特异性检测试剂是相同类型的分子(例如全部都是核酸)。在一些实施方式中，2、3、4、5或更多种序列特异性检测试剂中至少两种是相同类型的分子(例如至少两种是核酸)。在一些实施方式中，2、3、4、5或更多种序列特异性检测试剂是不同类型的分子(例如抗体和核酸)。
[0054]在一些实施方式中，该序列特异性检测试剂是肽、多肽或蛋白质。本文所用术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换地指代两个或更多个氨基酸残基的聚合物。该术语应用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然产生氨基酸的人造化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然产生的氨基酸聚合物和非天然产生的氨基酸聚合物。在一些实施方式中，该序列特异性检测试剂是抗体。本文所用“抗体”指免疫球蛋白家族的多肽或包含能够非共价、可逆并以特异性方式结合相应抗原的免疫球蛋白的片段的多肽。
[0055]术语抗体也包括通过全抗体修饰，或用重组DNA方法从头合成所产生(例如，单链Fv)，或用■菌体展示文库鉴定的抗体片段(参见如McCafferty等，Nature 348: 552-554(1990))。制备抗体的方法是本领域已知的；参见例如Kohler和Milstein ,Nature 256:495-497(1975);Kozbor等，Immunology Today 4:72(1983);Cole等，Monoclonal Antibodi