划分的样品接触检测试剂。
[0098]盤
[0099]样品可被划分为多个划分产物。划分产物可包括多种类型的划分产物中的任一种，包括固体划分产物(如孔或管)和流体划分产物(如油相内的水性液滴)。在一些实施方式中，这些划分产物是液滴。在一些实施方式中，这些划分产物是微通道。划分样品的方法和组合物描述于，例如，公开的专利申请WO 2010/036352,US 2010/0173394,US 2011/0092373和US 2011/0092376，其各自通过引用全文纳入本文。
[0100]在一些情况中，划分样品并将检测试剂(如探针)掺入至划分的样品中。在其他情况中，使样品接触检测试剂并随后划分样品。在一些实施方式中，各试剂(如探针、引物、缓冲剂、酶、底物、核苷酸、盐等)在划分前混合在一起，随后划分样品。在一些情况中，在将各试剂混合在一起后立即划分样品，使得基本所有或大部分反应(如逆转录、DNA扩增、DNA切割等)在划分后发生。在其它情况中，在反应进行缓慢或完全不进行的温度下混合试剂，然后划分样品，并且调节反应温度以使反应进行。例如，可在冰上、低于51、或0、1、2、3、4、5、
6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、20-25、25-30或30-35°(3或更高温度下合并试剂。一般而言，本领域技术人员会知晓如何选择一种或多种反应受到抑制的温度。在一些示例中，采用温度和时间的组合以避免划分之前的明显反应。
[0101 ]此外，可使用一种或多种热启动酶(例如热启动逆转录酶或热启动DNA聚合酶)混合试剂和样品。因此，可混合样品和缓冲剂、盐、核苷酸、探针、标记物、酶等中的一种或多种并随后进行划分。随后，由热启动酶催化的反应可通过加热混合物划分产物以激活一种或多种热启动酶来起始。
[0102]此外，可在不存在起始打算的反应(如逆转录或DNA扩增)所需的一种或多种试剂的情况下将样品和试剂(例如缓冲剂、盐、核苷酸、探针、标记物、酶等中的一种或多种)混合在一起。混合物然后可被划分成一组第一混合物划分产物中，然后可通过融合这组第一混合物划分产物和提供必要试剂的一组第二混合物划分产物来提供一种或多种必要试剂。或者，可向第一混合物划分产物中加入必要试剂，而不形成第二混合物划分产物。例如，必要试剂可分散到这组第一混合物划分产物油包水液滴中。作为另一个示例，缺失的试剂可被导向含有这组第一混合物划分产物的一组微通道中。
[0103]在一些实施方式中，将样品划分成多个液滴。在一些实施方式中，液滴包含乳液组合物，即不互溶的流体(如水和油)的混合物。在一些实施方式中，液滴是水性液滴，其被不互溶的运载体流体(如油)包围。在一些实施方式中，液滴是油性液滴，其被不互溶的运载体流体(如水性溶液)包围。在一些实施方式中，本文所述液滴是相对稳定的并在两个或更多个液滴之间具有最小聚结。在一些实施方式中，由样品生成的液滴中不到0.0001 %、0.0005%、0.001%、0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%与其他液滴聚结。这些乳液还可具有有限的絮凝，一种分散相以薄片从悬浮液中产生的过程。
[0104]在一些实施方式中，使油相流过包含待检测核酸的水性样品，从而形成液滴。在一些实施方式中，包含待检测核酸的水性样品还包含缓冲的溶液和一种或多种用于检测核酸的序列特异性检测试剂。
[0105]该油相可包含氟化基础油，其可通过与氟化表面活性剂(如全氟聚醚)联用而进一步稳定。在一些实施方式中，该基础油包括以下一种或多种:HFE7500、FC-40、FC-43、FC-70或另一种常见氟化油。在一些实施方式中，该油相包含阴离子含氟表面活性剂。在一些实施方式中，该阴离子含氟表面活性剂是Ammonium Krytox(Krytox-AS)、Krytox FSH的钱盐或Krytox FSH的吗啉基衍生物。Krytox-AS的浓度可以是约0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%、2.0%、3.0%或4.0%(￥/^)。在一些实施方式中，Krytox-AS的浓度是约1.8%。在一些实施方式中，Krytox_AS的浓度是约1.62% 0Krytox?3!1的吗啉基衍生物的浓度可以是约0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%、2.0%、3.0%或4.0% (w/w)。在一些实施方式中，Krytox FSH的吗啉基衍生物的浓度是约1.8%。在一些实施方式中，Krytox FSH的吗啉基衍生物的浓度是约1.62%。
[0106]在一些实施方式中，该油相还包含用于调节油性质(如蒸气压、粘性或表面张力)的添加剂。非限制性示例包括全氟辛醇和1!1，1!1，2!1，2!1-全氟癸醇。在一些实施方式中，1!1，1!1，2!1，2!1-全氟癸醇以约0.05%、0.06%、0.07%、0.08%、0.09%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%、1.25%、1.50%、1.75%、2.0%、2.25%、2.5%、2.75%或3.0%(?/?)的浓度添加。在一些实施方式中，1!1，1!1，2!1，2!1-全氟癸醇以约0.18% (w/w)的浓度添加。
[0107]在一些实施方式中，该乳液配制为生成具有类液界面膜的高度单分散液滴，其可通过加热转化为具有类固界面膜的微胶囊;这类微胶囊可作为生物反应器以通过一段时间的孵育保持其含量。转化为微胶囊形式可在一经加热后即发生。例如，这类转化可发生于超过约40°、50°、60°、70°、80°、90°或95°C的温度下。加热过程期间，流体或矿物油覆盖物可用于阻止蒸发。过量的连续相油可在加热前除去。这些微胶囊可在大范围的热和机械处理下抗聚结和/或絮凝。
[0108]转化后，这些微胶囊可储存于约-70°、-20。、0。、3°、4°、5°、6°、7°、8°、9°、10°、15°、20°、25°、30°、35°或40°C下。在一些实施方式中，这些微胶囊可用于储存或运输混合物划分产物。例如，可在一个位置处收集样品，划分为含有酶、缓冲剂和/或引物的液滴中，任选地可进行一个或多个逆转录、扩增或连接反应，然后可加热该划分产物以进行微囊化，并且可储存或运输微胶囊用于进一步分析。
[0109]这些微胶囊划分产物可含有一种或多种序列特异性或非特异性检测试剂并可抗聚结，特别是在高温下。因此，这些胶囊可在非常高的密度(例如每单位体积的划分产物数)下孵育。在一些实施方式中，可每毫升孵育超过100000、500000、1000000、1500000、2000000、2500000、5000000或10000000个划分产物。在一些实施方式中，样品-探针孵育发生在单个孔中，例如微量滴定板的孔，此时各划分产物之间没有内部混合。这些微胶囊还可含有孵育所需的其他组分。
[0110]在一些实施方式中，将样品划分成至少500个划分产物、至少1000个划分产物、至少2000个划分产物、至少3000个划分产物、至少4000个划分产物、至少5000个划分产物、至少6000个划分产物、至少7000个划分产物、至少8000个划分产物、至少10,000个划分产物、至少15,000个划分产物、至少20,000个划分产物、至少30,000个划分产物、至少40,000个划分产物、至少50，000个划分产物、至少60，000个划分产物、至少70，000个划分产物、至少80，OOO个划分产物、至少90 ,OOO个划分产物、至少100 ,OOO个划分产物、至少200 ,OOO个划分产物、至少300，000个划分产物、至少400，000个划分产物、至少500，000个划分产物、至少600，000个划分产物、至少700 ,OOO个划分产物、至少800 ,OOO个划分产物、至少900 ,OOO个划分产物、至少1,000，000个划分产物、至少2，000，000个划分产物、至少3，000，000个划分产物、至少4，000，000个划分产物、至少5，000,000个划分产物、至少10，000，000个划分产物、至少20，000，000个划分产物、至少30，000，000个划分产物、至少40，000，000个划分产物、至少50，000，000个划分产物、至少60，000，000个划分产物、至少70，000，000个划分产物、至少80，000，000个划分产物、至少90，000，000个划分产物、至少100，000，000个划分产物、至少150，000，000个划分产物或至少200，000，000个划分产物。
[0111]在一些实施方式中，该样品被划分为足量的划分产物，使得至少大部分划分产物具有不超过1个靶核酸(例如不超过约0.1、0.2、0.3、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个靶核酸)。在一些实施方式中，该样品被划分为使得一种革G核酸以高拷贝数/划分产物存在，而另一靶核酸以少量拷贝数/划分产物存在。例如，一种靶核酸可以是以约1、2、3、5、6、8、10、12、
14、15、20、25、30、50或更多个拷贝/划分产物存在的野生型序列。以少量拷贝数/划分产物存在的靶核酸可以是以少于划分产物的约10%、5%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%、0.005%、0.001%、0.0005%、0.00001%或更少存在的突变、多态性或稀有序列变体。在一些实施方式中，该样品被划分为足量的划分产物，使得至少大部分划分产物具有不超过5-10个靶和/或非靶核酸(例如不超过约0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个靶和/或非靶核酸)。在一些实施方式中，大部分划分产物具有不超过5-10个(例如不超过约0.5、1、2、3、4、5、6、
7、8、9或10个)待检测核酸。在一些实施方式中，各划分产物中存在平均约0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2、3、4或5个序列特异性检测试剂分子。
[0112]在一些实施方式中，生成的液滴在形状和/或尺寸方面基本均匀。例如，在一些实施方式中，这些液滴在平均直径方面基本均匀。在一些实施方式中，生成的液滴的平均直径为约0.001微米、约0.005微米、约0.01微米、约0.05微米、约0.1微米、约0.5微米、约I微米、约5微米、约1微米、约20微米、约30微米、约40微米、约50微米、约60微米、约70微米、约80微米、约90微米、约100微米、约150微米、约200微米、约300微米、约400微米、约500微米、约600微米、约700微米、约800微米、约900微米或约1000微米。在一些实施方式中，生成的液滴的平均直径为小于约1000微米、小于约900微米、小于约800微米、小于约700微米、小于约600微米、小于约500微米、小于约400微米、小于约300微米、小于约200微米、小于约100微米、小于约50微米，或小于约25微米。在一些实施方式中，生成的液滴在形状和/或尺寸方面是不均匀的。
[0113]在一些实施方式中，生成的液滴在体积上基本均匀。例如，液体体积的标准偏差可以低于约I皮升、5皮升、10皮升、100皮升、InL或低于约10nL。在一些示例中，液滴体积的标准偏差可低于平均液滴体积的约10-25%。在一些实施方式中，生成的液滴的平均体积为约
0.0011^、约0.0051^、约0.01乩、约0.02乩、约0.03乩、约0.041^、约0.05乩、约0.06乩、约
0.07nLj々0.08nLj々0.09nLj々0.1nLj々0.2nLj々0.3nLj々0.4nLj々0.5nLj々0.6nL、^t0.7nL、约0.8nL、约0.9nL、约 InL、约 I.5nL、约2nL、约2.5nL、约3nL、约3.5nL、约4nL、约
4.5nL、约5nL、约5.5nL、约6nL、约6.5]11^、约711]^、约7.5nL、约8nL、约8.5nL、约9nL、约9.5nL、约10nL、约llnL、约12nL、约13nL、约14nL、约15nL、约16nL、约17nL、约18nL、约19nL、约20nL、约 25nL、约 30nL、约 35nL、约 40nL、约 45nL 或约 50nL。
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