esand Cancer Therapy (《单克隆抗体和癌症治疗》)，第77-96页，ARL公司(Alan R.Liss ,Inc.)1985。在一些实施方式中，该序列特异性检测试剂是非抗体蛋白支架。本文所用“非抗体蛋白支架”指能够以高特异性结合鉴定特征的非免疫原性多肽。在一些实施方式中，该蛋白支架具有衍生自蛋白A、脂质运载蛋白、纤连蛋白结构域、锚蛋白共有重复结构域或硫氧还蛋白的结构。制备非抗体支架的方法是本领域已知的；参见例如Binz和Pluckthun，CurrOpinB1technol 16:459-469(2005) ;Koide等，J MolB1l 415:393-405(2012);以及GiIbreth和Koide,CurrOpinStructB1I 22:413-420(2012)。
[0056]在一些实施方式中，该序列特异性检测试剂是核酸。本文所用术语“核酸”和“多核苷酸”互换使用以表示脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其单链或双链形式的聚合物。基于核酸的检测试剂的不例描述于Juskowiak,Anal B1anal Chem.2011年3月；399(9): 3157-3176，其通过引用纳入本文。该术语包括含有已知核苷酸类似物或修饰的主链残基或连接的核酸，其可以是合成、天然产生的和非天然产生的，其与参比核酸具有相似结合性质，且以与参比核苷酸相似的方式代谢。这类类似物的例子包括但不限于:硫代磷酸酯、氨基磷酸酯(phosphoramidate)、膦酸甲酯、手性-膦酸甲酯、2_0_甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。合成多核苷酸的方法是本领域已知的。参见例如Carruthers等，Cold Spring HarborSymp.Quant.B1l.47:411-418( 1982)，和Adams等，J.Am.Chem.Soc.105:661 (1983)。在一些实施方式中，该序列特异性检测试剂是与感兴趣的核酸或序列杂交的寡核苷酸探针。在一些实施方式中，寡核苷酸探针的长度是至少约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、
19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、40、45、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000或更多个核苷酸。
[0057]在一些情况中，待使用序列特异性检测试剂检测的序列与靶或非靶核酸上序列之间的单个错配可导致检测试剂与靶或非靶核酸之间相互作用的解链温度下降约1、2、3、4、
5、6、7、8、9、10、11、12、15、18、20或约20°C。在一些情况中，额外的错配可导致解链温度的更大下降。
[0058]在一些实施方式中，该序列特异性检测试剂是线性寡核苷酸探针。例如，该序列特异性检测试剂可含有与感兴趣的核酸杂交的核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、核苷酸类似物或其组合的线性序列。在一些情况中，线性寡核苷酸探针可含有标记物或条码或额外的核酸序列，例如用于扩增或检测。在一些情况中，该序列特异性检测试剂含有在相邻位置处结合核酸的两种寡核苷酸。例如，在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或约20个核苷酸内结合的两种探针。在一些情况中，探针之一被供体分子标记且另一相邻探针被受体分子标记。供体分子的激发可导致荧光能量转移至相邻受体分子，如果两种探针都结合小于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或约20个核苷酸的距离内的模板核酸。
[0059]在一些情况中，该线性探针是水解探针。例如，双重标记的发荧光寡核苷酸探针通常在文献中称作“TaqMan”探针。序列特异性水解探针可含有两种不同的荧光染料标记的短(例如，长度为约20-25个碱基)多核苷酸。在一些情况中，该探针的5 ’末端接合报告染料，而3’末端接合淬灭部分。在其它情况中，染料可在探针上的其它位置处接合。所述探针可设计为与靶核酸上的探针结合位点具有至少基本的序列互补性。与侧接探针结合位点的区域结合的上游和下游PCR引物也可包括在反应混合物中。当所述发荧光探针完整时，荧光剂和淬灭剂部分之间发生能量转移，淬灭荧光剂的发射。PCR延伸阶段中，探针被切割(例如通过核酸聚合酶例如Taq聚合酶的5’核酸酶活性，或通过切割结合探针的单独提供的核酸酶活性)，从而使荧光剂和淬灭剂部分分离。这导致报告发射强度的增加，可用合适的检测器测量。
[0060]或者，该序列特异性试剂可以是结构化探针。结构化探针(例如，“分子信标”或“蝎型探针”)提供了检测核酸的另一种方法。通过分子信标，探针与靶核酸的互补区域杂交时对探针构象的改变导致形成可检测信号。除了靶标特异性部分以外，所述分子信标包括其他部分，通常一部分在5 ’端另一部分在3 ’端，它们彼此互补。一端部分通常接合报告染料，而另一端部分通常接合淬灭剂染料。溶液中两种端部分可彼此杂交以形成茎环结构。该构象中，报告染料和淬灭剂足够接近，以致报告染料的荧光被淬灭剂有效淬灭。相反，杂交的分子信标产生线性化构象，其中降低了猝灭程度。因此，通过监测报告染料的发射变化，可以检测核酸。此类探针及其使用方法还描述于，例如Piatek，A.S.，等，Nat.B1technol.16:359-63(1998)；Tyagi，S.和Kramer，F.R.，Nature B1technology 14:303-308(1996);和Tyagi，S.等，Nat.B1technol.16:49-53( 1998)。
[0061]蝎型探针通常由单链双重标记的荧光探针组成，其由探针两端上的约4-6个核苷酸的互补茎序列维持为约20-25个核苷酸的发夹环构象。该探针含有5’端报告染料和与聚合酶引物的5’端经由阻断物(blocker)直接连接的内部淬灭染料。该阻断物阻止聚合酶延伸该引物。报告染料紧邻淬灭染料导致报告物天然荧光的淬灭。聚合酶反应期间，聚合酶延伸引物并合成特异性靶序列的互补链。变性和复性解开发夹环，且该环区域与新合成的靶序列分子内杂交。这增大了淬灭染料与报告染料之间的距离，导致荧光增加。
[0062]在一些实施方式中，该序列特异性检测试剂是适体。本文中，“适体”指对鉴定特征物(如蛋白质或核酸)具有特异性结合亲和性的DNA或RNA分子。在一些实施方式中，适体选自基于其以基于与靶分子的非沃森克里克相互作用的高亲和特异性结合其他分子能力的随机池(参见例如，Cox 和 El lington ,B10rg.Med.Chem.9:2525-2531 (2001) ; Lee 等，Nuc.Acids Res.32:D95-D100(2004))。例如，可使用称为通过指数富集的配体系统性演化(SELEX)的选择过程选择适体。参见例如GoId等，US 5，270，163。可选择结合例如核酸、蛋白质、小有机化合物、维生素或无机化合物的适体。
[0063]在一些实施方式中，该序列特异性检测试剂是核酸引物或一组核酸引物。例如，该序列特异性检测试剂可以是设计为与靶分子杂交并起始聚合酶反应的核酸引物。在一些情况中，该引物是用于从RNA模板中合成第一和/或第二链DNA的引物。在一些情况中，该引物是用于生成双链核酸(如双链DNA)的引物。在一些情况中，该引物是PCR引物或用于本领域已知的其他核酸扩增技术的引物，包括但不限于连接酶链式反应(LCR)、基于转录的扩增系统(TAS )、基于核酸序列的扩增(NA SBA )、链置换扩增(SD A )、滚环扩增(RCA )、高分支RCA(HRCA)，和嗜热解旋酶依赖性DNA扩增(tHDA)。
[0064]非特异性检测试剂
[0065]本发明所述的非特异性检测试剂包括适用于检测核酸的任何染料。在一些实施方式中，该非特异性检测试剂是结合核酸的染料。在一些情况中，该染料是结合核酸的荧光染料。在一些情况中，该荧光染料在结合核酸后增加荧光。在一些情况中，该非特异性检测试剂是嵌入双链核酸(如双链DNA、双链RNA或RNA: DNA杂交体)中的染料。嵌入染料包括适用于检测双链核酸的任何嵌入染料。这类嵌入染料包括，例如，9-氨基吖啶、溴化乙啶、菲啶染料、EvaGreen、PIC0 GREEN(P_7581，分子探针公司(Molecular Probes))、EB(E_8751，西格玛公司(Sigma))、碘化丙啶(P-4170，西格玛公司)、吖啶橙(A-6014，西格玛公司)、噻唑橙、噁唑黄、7-氨基放线菌素D(A-1310，分子探针公司)、花青染料(如TOTO、YOYO、BOBO和POPO)、SYTO^SYBR Green I (美国专利号5,436，134:N’，N’_二甲基-N_[4_[ (E)-(3_甲基-1，3_苯并噻唑-2-亚基)甲基]-1-苯基喹啉-1-鑰-2-基]-N-丙基丙烷-1,3-二胺)、SYBR Green II(美国专利号5，658，751)、SYBR DX、01iGreen、CyQuant GR^SYTOX Green、SYT09、SYT010、SYT017、SYBR14、FUN-1、DEAD Red、碘化己啶、溴化乙啶、二氢乙啶、溴乙啡锭二聚体、9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶、DAP1、DIP1、吲哚染料、咪唑染料、放线菌素D、羟芪巴脒、LDS 751(美国专利号6,210,885)，以及以下文献中描述的染料:Georgh1u,Photochemistry andPhotob1logy (《光化学和光生物学》)，26: 59-68，培格曼出版公司(Pergamon Press)(1977);Kubota等，B1phys.Chem.,6: 279-284( 1977);Genest等，Nuc.Ac.Res., 13: 2603-2615(1985) ；Asseline,EMBO J.,3:795-800(1984) !Richardson等，美国专利号4,257,774;以及Letsinger等，美国专利号4，547，569。
[0066]在一些实施方式中，该非特异性检测试剂是与可检测标记物偶联的非特异性核酸结合剂。例如，该非特异性检测试剂可以是与可检测标记物偶联的嵌入试剂。在一些情况中，该非特异性检测试剂可以是与可检测标记物偶联的蛋白质。能够非特异性结合核酸的不例性蛋白质包括单链DNA结合蛋白和组蛋白。
[0067]在一些实施方式中，该非特异性检测试剂是寡核苷酸。例如，与可检测标记物偶联的寡核苷酸。在一些实施方式中，核酸非特异性检测试剂与通用杂交序列杂交。在一些情况中，该通用杂交序列已通过扩增、连接或聚合化掺入至样品中的核酸中。例如，通过含有杂交序列的随机引物来扩增样品中的核酸。
[0068]在一些实施方式中，该非特异性检测试剂在聚合化期间生成。例如，扩增或第一或第二链合成期间从RNA模板中生成。在一些情况中，该非特异性检测试剂是经标记的核苷酸(例如标记有生物素、放射性同位素、荧光团等的核苷酸)，其通过扩增、连接或聚合化掺入样品中的核酸中。
[0069]可检测标记物
[0070]通过检测连接至各试剂的标记物来检测本文所述的检测试剂。该标记物可直接连接至检测试剂(例如通过共价键)或可以间接接合(例如使用螯合剂或接头分子)。术语“标记物”和“可检测标记物”在本文中同义使用。在一些实施方式中，各标记物(如连接至第一检测试剂的第一标记物、连接至第二检测试剂的第二标记物等)生成可检测信号且这些信号(例如第一标记物生成的第一信号、第二标记物生成的第二信号等)是可区分的。在一些实施方式中，两种或更多种标记物包含相同类型的试剂(例如第一标记物为第一荧光剂且第二标记物为第二荧光剂)。在一些实施方式中，两种或更多种标记物(如第一标记物、第二标记物等)联合生成可检测信号，该可检测信号是在一种或多种标记物不存在时无法生成的。
[0071]可检测标记物的示例包括但不限于:生物素/链霉亲和素标记物、核酸(例如寡核苷酸)标记物、化学反应性标记物、荧光标记物、酶标记物、放射性标记物、量子点、聚合物点、质量标记物及其组合。在一些实施方式中，该标记物可包括光学试剂，如焚光剂、磷光剂、化学发光剂等。多种试剂(如染料、探针或指示剂)是本领域已知的并可用于本发明。(参见例如英杰公司(Invitr