mClover3 和 mNeonGreen 是 mRuby3 的 最有效的供体。
[0026] 另一方面，本发明还提供了所述的红色荧光蛋白在作为荧光共振能量转移受体中 的应用。具体地，其中，所述荧光共振能量转移的供体可选自以下蛋白：mEGFP、Envy、 mNeonGreen、Clover或本发明所述的新的绿色焚光蛋白。
[0027] 本发明还提供了所述的绿色荧光蛋白在作为荧光共振能量转移供体中的应用。具 体地，其中，所述焚光共振能量转移的受体选自以下蛋白：mCherry、mKate2、FusionRed、 mRuby2或mRuby3。
[0028] 本发明还提供了一种能用于荧光共振能量转移成像的蛋白对，其包括：
[0029] 本发明所述的新的红色荧光蛋白作为荧光共振能量转移受体;和/或
[0030] 本发明所述的新的绿色荧光蛋白作为荧光共振能量转移供体。
[0031] 本发明还提供了一种可用于光学成像的基因编码生物传感器，该生物传感器包 括：
[0032] 本发明所述的新的红色荧光蛋白作为荧光共振能量转移受体;和/或
[0033] 本发明所述的新的绿色荧光蛋白作为荧光共振能量转移供体。
[0034] 与普遍使用的基因编码的生物传感器相比，本发明的传感器在荧光成像过程中可 以有效降低成像背景干扰信号，显著提高了荧光成像的灵敏度，使得成像更加清晰。由于该 传感器的光稳定性有了极大地提高，有效的延长了可成像时间，使得长时间观察某种反应 或现象更加容易。由于该传感器光毒性的减小，减轻了实验过程中对细胞的正常反应和功 能的影响，使得实验结误差减小，实验结果更贴近真实。
[0035] 具体地，在本发明的一具体实施方案中，分别构建了以Clover和mRuby3为FRET对 的〇&11111丨€[传感器0&11111丨€[-0?3，111(]1〇￥613和1111?1^73为？1^1'对的0&1]111丨€[传感器0&1]111丨€[-031?3， mNeonGreen和mRuby3为FRET对的Camuia传感器Camuia-NR3，测试在Camuia指不器中新的红 色和绿色焚光蛋白在提高FRET基线的能力，结果显示mClover3_mRuby3和mNeonGreen3_ mRuby3在Camuia中改善了反应效果。
[0036] 另一方面，本发明还开发出了一套评估荧光蛋白在哺乳动物细胞系中作为独立标 记和基因编码生物传感器的标准评估方法，通过该评估方法检验荧光蛋白衍生物在哺乳动 物细胞系中的表达所产生的荧光信号强度。
[0037] 本发明与普遍使用的基因编码的生物传感器相比有5大优点：（1)选取绿色和红色 荧光蛋白相融合，代替原有青色和黄色荧光蛋白相融合，以绿和红两种颜色的荧光团相搭 配，使得光谱分隔的距离变大，减轻了干扰，提高了灵敏度。（2)荧光蛋白的光稳定性出现了 极大的提高，焚光蛋白mClover3相比于前一代Clover提高了60%。而mRuby3相比于前一代 mRuby2提高了200%，使得mRuby3蛋白成为目前为止光稳定性最强的单体红色焚光蛋白。 (3)荧光蛋白的光亮度也有较大的提高，例如mRuby3比前一代mRuby2要亮35%，使得mRuby3 成为目前为止光亮度最亮的红色荧光蛋白。（4)高表达，经过转染哺乳动物细胞系后，对细 胞成像灵敏度高于现在普遍使用的生物传感器。（5)mRuby3是延时拍摄成像和光量子受限 制情况下检测蛋白的良好探针，包括快速延时拍摄成像和单分子成像。
【附图说明】
[0038] 图Ia显示mRuby3与mRuby2蛋白质一级结构的序列及对比结果。
[0039] 图Ib为mRuby3与mRuby2的突变对比晶体结构图。
[0040] 图1(：为红色焚光蛋白111〇161^7、1111(&七62、？118；[0111^(1、1111?油7 2和1111?油73的吸收图（左） 与发射图（右）。
[0041 ] 图Id显示了mRuby3、mRuby 2和mRuby 2-M1601突变体在细菌培养箱中培养后的荧光 图。
[0042] 图2a为在HeLa细胞中表达mRuby3融合蛋白后对特定的亚细胞结构的荧光成像图。 从左到右：mRuby3-7aa_actin(肌动蛋白细胞骨架），mRuby3-6aa_tubulin(微管）， connexin43 (细胞粘附接点）-7aa_mRuby3，mRuby3_10aa_H2B (核小体）。中间aa代表连接两 个蛋白之间的距离的单位，以单个氨基酸距离为1个aa。
[0043] 图2b显示在HEK293A和HeLa细胞中四种单体红色荧光蛋白mCherry ,FusionRed， mRuby 2和mRuby 3的亮度比较。
[0044] 图3a显示mClover3、dClover2和Clover的蛋白质一级结构的序列及对比结果。 [00 45]图3b为mClover3与Clover相比突变位点的晶体结构图。
[0046] 图3c为绿色焚光蛋白mEGFP、Envy、111如〇116代611、(]1〇￥61'和〇1〇￥613的吸收（左）和发 射(右)光谱图。
[0047]图4a为在HeLa细胞中表达mCl〇Ver3融合蛋白后对特定的亚细胞结构的荧光成像 图。从左到右:mClover3-7aa_actin(肌动蛋白细胞骨架），mClover3-6aa_tubulin(微管）， connexin43(细胞粘附接点）-7aa_mClover3，mClover3-10aa_H2B(核小体）。中间aa代表连 接两个蛋白之间的距离的单位，以单个氨基酸距离为1个aa。
[0048] 图牝显示在册1(2934和他1^细胞中通过表达6??-?24-111〇^^7，对六种单体绿色荧 光蛋白的亮度比较。
[0049] 图4c为在HEK293A和HeLa细胞中三种GFP_mRuby3蛋白的荧光共振能量转移的效率 对比图。
[0050] 图5a显示与Camuia连接的绿色/红色FRET对的结构。
[0051 ]图5b显示绿色/红色表达Camuia的HeLa细胞在没有钙离子载体刺激的情况下供 体/受体的发射比率(RDA)。数据以均值±标准差形式表现。
[0052] 图5c中，左图片为平均供体/受体的发射比率（RDA)随时间的变化图，右图片为 HeLa细胞在钙离子载体刺激下反应所得到的强度比率图。每个细胞的发射比率的变化在图 中用灰色线表示，平均值用黑色线表示。数据以均值土标准差形式表现。将Camuia-CR分别 与Camuia-C3R3和Camuia-NR3在激发峰值处的比率有统计学差异。
【具体实施方式】
[0053] 为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例 仅用于解释而不以任何方式限制本发明。以下各实验中，各原始试剂材料均可商购获得，未 注明具体条件的实验方法包括定点突变技术、融合蛋白技术、人工脂质体细胞转染技术等 为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。
[0054] 本发明各实验中所用主要技术和实验方案包括：
[0055] (1)荧光共振能量转移的距离模型。
[0056]建立的模型的公式为.Α-(λ) = ε〇(λεχ)[(1 -五)X φ0 χ/0(λ> + 丑 X φΑ Χ/Α(λ)] + εΑ(υ χΑ(λ)，./total表不在某一波长处的焚光强度。ED(Aex)表不在激发波长下供体的消光系数。E表 示荧光共振能量转移效率。 cPd是表示供体的量子产率。fD(>)表示在波长λ处供体的已标准 化的发射光。EA(A e3x)是表示在激发波长下受体的消光系数。而内部荧光基团距离 (interfluorophore distance，r)通过福斯特(F5rster)公式E = 1/(l+(r6/r〇6)算出，r〇为福 斯特（F5stCf)半径。
[0057] (2)重组质粒构建
[0058] 质粒构建包括:聚合酶链式反应(PCR)，重叠延伸聚合酶链式反应(overlap PCR)， 限制性酶切反应和In-Fusion连接，转化DH5a细菌。所有重组载体通过测序鉴定。
[0059] (3)HeLa和HEK293A细胞培养和转染
[0060]利用脂质体转染法将重组质粒转入HeLa和HEK293A细胞中，3-5小时后更换培养 液，培养24小时后将细胞消化后，分装到8孔板中，再培养24小时。
[0061] (4)荧光显微镜观察融合蛋白
[0062] 对于mClover3-mRuby3融合蛋白，在转染到HeLa细胞中24-72小时后，利用FVlOOO 激光共聚焦显微镜成像。对于mClover3，在488nm激发光下激发，收集500-600nm的光。对于 mRuby3,在559nm处激发，收集570-670nm处的光。所得到的图像用软件ImageJ处理。
[0063] (5)荧光蛋白的体外特征
[0064] 由于荧光蛋白的N-末端连接有六个组氨酸，所以使用钴树脂纯化(HisPur Cobalt Resin)。而吸光度，激发光谱和发射光谱通过多功能酶标仪SafireII测量出来。消光系数通 过变性方法(对于每个蛋白样品，准备完全一样两份溶液，蛋白溶解在PBS中。其中一份测量 吸收峰，另外一份在IN NaOH作用下测量吸收峰，通过公式'变性前/变性后*44000 '计算出 消光系数)测出，而量子产率则以Clover和mRuby2为参考(分别测量待测样品和参考蛋白的 发射谱和吸收谱，然后分别计算发射谱面积和获得发射谱的吸收值，然后将发射谱面积除 以吸收值，然后将待测样品的上述比值除以参考蛋白的比值，然后乘以参考蛋白的量子产 率，即可得知待测蛋白的量子产率）。
[0065] 在体外的光漂白实验中，以纯化的蛋白质在为样品，使用倒置荧光显微镜油镜，使 用40X0.90-NA UPlan S-Apo物镜，使用X-Cite 120-瓦金属卤化物灯在100%中性密度分 别透过一个545/30nm的激发滤波器(对mRuby突变体而言）和一个485/30nm激发滤波器(对 Clover突变体而言）。在金属氯化物光源连续照射下，每1秒采集一次图像(相机为ORCA-ER (XD)，倍数也调整为产生光子输出率为1000光子每秒。
[0066] 凝胶过滤层析实验中使用复合凝胶柱(Superdex 200 30/100GL column)。上样量 为IOOyU浓度为10μΜ。