专利名称：五重荧光pcr快速超敏检测试剂盒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于核酸检测技术领域，具体而言，本发明涉及能同时对沙眼衣原体、淋病奈瑟菌、解脲支原体、人型支原体和生殖支原体等五种致病病原体进行检测的多重实时PCR方法，其快速、超敏且一步完成。另外，本发明还涉及上述PCR方法中所涉及的试剂，如互不相干绕的引物、探针等，以及用于上述方法的检测试剂盒和相应检测试剂盒的制备应用等。
背景技术：
淋病奈瑟菌(NG)、沙眼衣原体(CT)、解脲支原体(UU)、人型支原体(MH)、生殖支原体(MG)是引起泌尿生殖系统感染的5种主要病原体，可引起尿道炎、前列腺炎、宫颈炎、输卵管炎甚至不孕不育等。其中，淋病奈瑟菌(Niesseria gonorrhoeae, NG)是引起淋病的病原体，而淋病一直是性传播疾病中最常见的疾病，可引起严重的泌尿生殖道疾病，尤其是女性患者常导致盆腔炎症性疾病和继发不孕；沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis, CT)也是重要的性传播疾病的病原体之一，可以导致阴道、尿道和上行的生殖道感染，也能导致盆腔炎、输卵管损伤；解脲支原体(Ureaplasma urealyticum, UU)是引起泌尿生殖道炎症(NGU)及男女不育不孕的主要病原体，也是性传播的常见病原体，是常见的泌尿生殖寄生物；人型支原体(Mycoplasma hominis, MH)是成人泌尿生殖道的一种常见的微生物，和某些妇科、男性疾病有关，也和新生儿呼吸道感染、中枢神经系统感染有关；生殖支原体(Mycoplasma genitalium, MG)可引起非淋菌性尿道炎(NGU)、前列腺炎、宫颈炎、子宫内膜炎、附件炎及不孕，同时可能在HIV感染中起着重要的作用，被称为“AIDS相关支原体”。美国自1995年开展生殖道衣原体感染病例报告工作以来，其发病率很高，在180/万以上；非洲性病发病率更高，如津巴布韦卫生系统较为完善，全国1000多万人口，I年报告的性病病例就达80万，占总人口近10%。而随着我国改革开放的不断深入，社会经济不断发展，人口流动不断加强，性病的感染的有逐年上升的趋势，目前我国淋病和梅毒发病率高于发达国家，低于非洲国家，而且我国性病的发病率仍保持快速增长，1991 - 2000年全国性病平增长19. 30%，尤其是梅毒、生殖器疱疹和N⑶增长幅度在40%以上，而且性病和艾滋病的流行密切相关，性病的流行将促进艾滋病的传播。现在对淋病奈瑟菌、解脲支原体、人型支原体、生殖支原体的检测主要以培养法为主；沙眼衣原体主要针对其抗原进行免疫学检测。培养法检测耗时长，一般需经48-72小时才能得到结果；灵敏度低，受采集、运送、保存等影响较大，容易出现假阴性结果；操作烦琐，导致各种操作的结果判别标准难以统一，需要的技术和设备要求高。免疫学方法相比培养法有了长足的进步，但是因为生殖道微生物之间存在的交叉反应使得该方法的特异性受到影响，容易出现假阳性反应，给治疗带来误判的可能。近年也有报道利用聚合酶链反应(PCR)来实施对病原体的检测。PCR是当今核酸检测中最常用的技术之一，其中实时(Real Time)PCR技术采用了诸如荧光标记等可实时检测的标记，在核酸检测、临床诊断及分子生物学研究等方面，可以快速地获得结果。常规的实时 PCR 检测，如中国专利 CN1768151A、CN101189505A、CN101273262A、CN101302473A 等，仅用于检测单一靶核酸；中国专利CN101624629A公开了(在单个PCR反应容器中)多重检测样品中靶核酸的实时PCR方法，执行速度更快、更整合，但是其仅仅用于检测HBV、HCV和HIV等三种靶核酸，没有更多重检测的实践，例如没有关于如何设计互不干扰的引物对和探针的提示，更没有提示对探针浓度的进行调整。然而，对于更多重的实时PCR检测，尤其是对于淋病奈瑟菌(NG)、沙眼衣原体(CT)、解脲支原体(UU)、人型支原体(MH)、生殖支原体(MG)这五种病原体(其中三种支原体的同源性较高)来说，通过目前已知的引物对和探针序列设计方法(包括现有的生物信息学软件)，无法设计出这五重互不干扰的引物对和探针，设计出的将导致互相干扰而使得荧光检测曲线失真。为此，本发明人经过艰苦的努力并且凭借了一些运气，针对这五种病原体，设计出了互相干扰程度在实时PCR检测中可接受的引物对和探针，更令人意外的是，在探针浓度上进行了调整，增强了它们的检测曲线都能的清晰度和分辨度(曲线相互分离)，使得检测灵敏度达到了超敏级，而且可以不使用内对照。另外，本发明对于上述微生物的核酸提取方法进行了优化。
发明内容
本发明的要解决的问题在于提供新的五重实时PCR方法，用于五重检测样品中淋病奈瑟菌、沙眼衣原体、解脲支原体、人型支原体和生殖支原体，通过互相干扰程度在实时PCR检测中可接受的引物对和探针，并任选优化探针浓度和核酸提取的过程，可以同时高特异性、高灵敏度和高重复性地分辨出样品中是否存在来自上述微生物的靶核酸。另外，本发明还涉及提供上述方法的检测试剂盒和应用等。具体而言，在第一方面，本发明提供了在单个PCR反应容器中五重检测核酸提取液中靶核酸的实时PCR方法，所述靶核酸来自淋病奈瑟菌、沙眼衣原体、解脲支原体、人型支原体和生殖支原体，其包括，(I)在所述单个PCR反应容器中混合核酸提取液、DNA聚合酶、dNTP、靶核酸引物对和靶核酸探针，其中所述探针标记有荧光基团和淬灭基团，而且各种探针标记的荧光基团的荧光检测波长互不相同，其中，靶核酸引物对包括 NG-F:ACCGTAACGTCTCTAAGTC,NG-R:GCAAGATTTCCGATTTGGC,CT-F:TGTCCATATCTTTGATACGAT,CT-R:CTCTGATATTTGAAGACTCTACA,UU-F:CTGCTCGTGAAGTATTACA,UU-R:GTACCATCTGGGAAAGTAC,MH-F:TGTGGTTTAATTTGAAGATACAT，MH-R:AGTCCTCAACTTAATGTTAGA,MG-F:AGGCAGTAATGTCAATCACA,和MG-R:GGCTTTATCATTGGCAAACG，靶核酸探针包括NG-P:CAGACATCACGCACCGAAGCAT，
CT-P:CCAAGCCGAGTCTACAGTTATAGGTCA，UU-P:ACCAACCATTGTATCTACACCTTCCATA，MH-P:CCACTCTTGACATCCTTCGCATA，和MG-P:CCATTCGCATCCAACTTCACCTCT ；(2)进行PCR反应，并实时检测不同波长的荧光；和，(3)根据荧光检测结果计算出的Ct值判断是否有靶核酸存在于样品中。可以对核酸提取液进行直接检测，但是优选对样品进行处理后获得核酸提取液后再进行检测。所以，优选核酸提取液是提取样品中的核酸而获得的提取液，如是采用磁珠提取法提取的。非特异性的磁珠提取法采用表面涂有非特异性核酸吸附类物质的顺磁性颗粒，在低PH(如，pH值5 7)和高盐浓度的情况下核酸可以吸附到顺磁性颗粒表面，在进行磁 分离和充分洗涤后，在高pH(如，pH值8、)、低盐浓度的条件下可将核酸洗脱下来，由此富集了核酸(如靶核酸)的样品可用于PCR试验；另外还可以采用特异性吸附(如杂交吸附和免疫吸附)的磁珠提取法。这些处理过程对于本领域技术人员来说是熟知的，也可参见郑秀芬等，模板DNA磁珠提取法·中国法医学杂志，18(3):107-108 ;中国专利200610030229.5、200710118802. 2 和 201110105181. O 等。优选采用本发明人进一步优化的磁珠提取法，其对于同时提取淋病奈瑟菌、沙眼衣原体、解脲支原体、人型支原体和生殖支原体中的核酸，更为可靠，步骤也方便。优选的提取受试品中的核酸的过程是向样品加入核酸萃取液(优选核酸萃取液包含异硫氰酸胍、乙二胺四乙酸钠、吐温-20、高氯酸钠、乙醇和pH缓冲液(如，Tris-HCl ))，保温后加入磁珠，混合均匀后，施加磁场后，弃去其中液体，然后洗涤(优选洗涤两次，更优选其中第一次洗涤所用的洗涤液包含高氯酸钠和乙醇，也更优选其中第二次洗涤所用的洗涤液包含乙醇)，并洗脱(优选洗脱所用的洗脱液包含PH缓冲液(如，Tris-HCl ))。因此，本发明优选提供了五重检测样品中淋病奈瑟菌、沙眼衣原体、解脲支原体、人型支原体和生殖支原体的方法，其包括，(A)提取样品中的核酸，获得核酸提取液；和，(B)对核酸提取液实施本发明的第一方面的在单个PCR反应容器中五重检测样品中靶核酸的实时PCR方法。在本文中，所检测的“样品”是潜在可能含有靶核酸或微生物的离体样品，如食品、血液、血液制品、尿液、唾液、医疗用品或药品等。本发明的方法优选不是诊断方法，如可用于公共卫生领域的血液样品检测(如，输血前血液样品检测，其直接目的是判断是否可以使用该血液样品，而非对患者进行诊断)，以及检验检疫领域的产品安全检测(如，衣物是否污染有上述微生物，其直接目的是检测产品质量)。本发明的方法优选仅限于对离体样品的检测，检测的直接结果是靶核酸或微生物的存在性与否。即使对于利用本发明的检测方法检测人或动物的血液样品中病原体(如，病毒)上的靶核酸，也只能直接得出靶核酸的存在与否，还需要有经验的医生或取样人员判断检测出的靶核酸是来自于血液中的病原体还是取样时不慎污染的病原体，而不能直接得到疾病的诊断结果或健康状况；即使靶核酸来自于血液中的病原体，也只能说明相应人或动物是相应病原体的携带者，还需要有经验的医生根据相应人或动物的体质、病史、临床症状等综合情况才能判断出是否会造成疾病或对健康状况有影响。
在本文中，“单个PCR反应容器”指所述实时PCR方法在技术上是在同一个容器中进行的，没有必要更换容器。最优选其中所述容器是PCR反应管，其它可以进行PCR反应并可进行实时荧光检测的容器也在本发明的保护范围内。在本发明第一方面的实时PCR方法中，在同一个容器中就可以完成PCR扩增和实时检测的步骤，整个过程不必更换容器，因而方便了操作者。操作者只需要向容器中加入样品与各种试剂即可，就可以通过市售的普通实时荧光PCR仪来自动完成，整个过程操作者只需添加样品和试剂即可，非常方便。尤其是，整个过程只需添加样品和试剂的步骤干预，便于实现全自动操作，如使用中国专利申请2007100030261公开的自动微量加液系统(即，吸取和分配实验液体的移液装置及带有该装置的PCR仪)，即可完成本发明检测方法的全过程自动化，从而节约了人力成本并最大程度降低了人为失误的可能性，因此本发明的检测方法便于自动化所带来的成本和可靠性优势是可以预期的。在本文中，“五重”检测指的是同时检测的核酸(或其所代表的微生物)有五种，即淋病奈瑟菌、沙眼衣原体、解脲支原体、人型支原体和生殖支原体。 在实时荧光PCR反应中，Ct值表示每个PCR反应管内荧光信号到达实时荧光PCR仪所默认设定的阈值时所经历的循环数，其具有良好的再现性，因此可以用于作为判读结果的优良指标。在本发明的第一方面的方法中，对于步骤(3)，其中一种靶核酸的荧光检测结果计算出的Ct值< 45，则这种靶核酸存在于样品中；一种靶核酸的荧光检测结果计算出的Ct值>45，则这种靶核酸不存在于样品中。这是我们经过长期大量试验摸索出来的经验，可靠性和重复性俱佳。因此也优选在本发明的第一方面的方法中，优选不采用内对照核酸。本发明人发现，如果提高探针的浓度，可以进一步提高本发明的第一方面的方法的检测灵敏度。所以，优选在本发明的第一方面的方法中，每种靶核酸探针在在所述单个PCR反应容器中的浓度大于5pmol/ml,优选为6 12pmol/ml,更优选为7 10pmol/ml,最优选为8pmol/ml。另外，优选在本发明的第一方面的方法中，在步骤(I)中所述单个PCR反应容器中还进一步混合有PCR反应所需的其他试剂，如盐。还优选了甘油浓度，用以延长PCR条件下酶活耐久力。在本发明的具体实施方式
中，盐优选是Mg盐。本领域技术人员还可以容易地选择出其他pH缓冲剂(如磷酸缓冲液等)来调节到合适的pH，也可以容易地选择出其他可溶性盐(如KCl等)来调节离子强度。另外，还可以进一步混合有抗氧化剂(还原剂)、蛋白(酶)保护剂(如，牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)等)。这些成分的选择对于本领域技术人员来说都是熟知的。在本文中，核酸按照本领域所常用的表示方法表示，其序列如未特别指出，均为5’端到3’端方向。其中，探针上标记有荧光标记物。荧光标记物可以位于探针的5’端、内部和/或3’端，优选位于5’端和/或3’端。在本发明的第一方面的方法中，不同种探针(之间所标记的荧光基团的荧光检测波长互不相同，这样能够同时或快速地顺序扫描不同的检测波长，分别记录下各种荧光基团的荧光变化，从而能够进行同时检测。在本文中，探针具有本领域技术人员所熟知的含义，其由为能与扩增出的靶核酸单链结合的单链DNA。通常，在每种探针的核苷酸序列的5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团。优选其中各种探针标记有不同的荧光基团。优选荧光基团及其淬灭基团是市售的，如可以采用FAM /SYBR Green I、yic:' /JOE/HEX、NED /TAMRA / Cy3^、R0X /Texas Re￡f 和Cy5 等常规产品，它们的检测波长互不相同，也可以委托公司合成标记有荧光标记的探针。在本发明的具体实施方式
中，其中采用的标记有不同检测波长的荧光标记的探针都是委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成的，纯度达到HPLC纯，不含杂带。优选在本发明的第一方面的方法中，各种探针标记有不同的荧光基团。在本发明的具体实施方式
中，优选的荧光基团是FAM、VIC、NED、Texas Red和 CY5。本领域技术人员能够根据引物及相应需要PCR扩增的核酸来设计PCR反应条件。对于本发明的五重检测，为了平衡不同种核酸的扩增条件，本发明人经过长期摸索，优化出的条件为PCR反应的每个循环的条件为94°C 10秒、55°C 15秒以及65°C 45秒。在本发明的具体实施方式
中，PCR反应优选先25°C保温5分钟并94°C变性10分钟，然后进行上述条件的45个循环。在第二方面，本发明提供了用于在单个PCR反应容器中五重检测核酸提取液中靶核酸的实时PCR方法的检测试剂盒，其包括DNA聚合酶、dNTP、靶核酸引物对和靶核酸探针，其中所述探针标记有荧光基团和淬灭基团，而且各种探针标记的荧光基团的荧光检测波长互不相同，其中，靶核酸引物对包括 NG-F:ACCGTAACGTCTCTAAGTC，NG-R:GCAAGATTTCCGATTTGGC，CT-F:TGTCCATATCTTTGATACGAT，CT-R:CTCTGATATTTGAAGACTCTACA，UU-F:CTGCTCGTGAAGTATTACA，UU-R:GTACCATCTGGGAAAGTAC,MH-F:TGTGGTTTAATTTGAAGATACAT，MH-R:AGTCCTCAACTTAATGTTAGA,MG-F:AGGCAGTAATGTCAATCACA，和
MG-R:GGCTTTATCATTGGCAAACG,靶核酸探针包括NG-P:CAGACATCACGCACCGAAGCAT，CT-P:CCAAGCCGAGTCTACAGTTATAGGTCA，UU-P:ACCAACCATTGTATCTACACCTTCCATA，MH-P:CCACTCTTGACATCCTTCGCATA,和MG-P:CCATTCGCATCCAACTTCACCTCT。在试剂盒中，不同的试剂可以分装在不同容器中，也可以选择几种长期保存而不发生化学反应的试剂合并保存在相同的容器中。容器可以是瓶、盒、注射器等能容纳上述试剂的容器，例如常规用于装PCR、酶或核酸试剂的容器。检测试剂盒中还可以有标签或说明书，用以指示按照本发明第一方面所述方法进行操作。标签可以贴在上述容器上，或者直接打印到上述容器上，也可以提供独立的说明书。根据需要，如方便运输、存放的需要，试剂盒还可以进一步包装进更大的包装中，这样的产品也在本发明的范围内。对于本发明第二方面的检测试剂盒，其中优选的各成分如本发明第一方面所述的那样优选。优选诸如，其中各种探针标记有不同的荧光基团，更优选荧光基团是FAM、VIC、NED、Texas Red和CY5 ;其中每种靶核酸探针在在所述单个PCR反应容器中的浓度大于5pmol/ml,优选为6 12pmol/ml,更优选为7 10pmol/ml,最优选为8pmol/ml。也优选其中不含有内对照核酸。在第三方面，本发明提供了本发明第二方面所述的试剂盒在制备用于在单个PCR反应容器中五重检测核酸提取液中靶核酸的实时PCR方法的检测试剂产品中的应用，优选提供了本发明第二方面所述的检测试剂盒在制备用于本发明第一方面所述方法的检测试齐U产品中的应用。在本文中，检测试剂产品可以是检测试剂盒本身，也可以是合并装有多个检测试剂盒的更大包装产品。根据前文所述，本领域技术人员很容易理解其中检测试剂盒的成分以及其中方法的流程。试剂盒中还可以包含提取样品中的核酸获得核酸提取液所用的试剂。因此，在第四方面，本发明提供用于五重检测样品中淋病奈瑟菌、沙眼衣原体、解脲支原体、人型支原体和生殖支原体的检测试剂盒，其包括本发明的第二方面的试剂盒和磁珠提取法所需试剂。优选其中磁珠提取法所需试剂包括，核酸萃取液，优选核酸萃取液包含异硫氰酸胍、乙二胺四乙酸钠、吐温-20、高氯酸钠、乙醇和pH缓冲液(如，Tris-HCl)；第一次洗涤所用的洗涤液，优选其包含高氯酸钠和乙醇；第二次洗涤所用的洗涤液，优选其包含乙醇；和，洗脱所用的洗脱液，优选其包含pH缓冲液(如，Tris-HCl)。相应地，在第五方面，本发明提供了本发明第四方面所述的试剂盒在制备用于五重检测样品中淋病奈瑟菌、沙眼衣原体、解脲支原体、人型支原体和生殖支原体的检测试剂中的应用。在第六方面，本发明提供了互不干扰实时PCR的核酸混合物，其是引物或探针的混合物，所述引物或探针选自NG-F:ACCGTAACGTCTCTAAGTC,NG-R:GCAAGATTTCCGATTTGGC,CT-F:TGTCCATATCTTTGATACGAT，CT-R:CTCTGATATTTGAAGACTCTACA,UU-F:CTGCTCGTGAAGTATTACA,UU-R:GTACCATCTGGGAAAGTAC,MH-F:TGTGGTTTAATTTGAAGATACAT，MH-R:AGTCCTCAACTTAATGTTAGA,MG-F:AGGCAGTAATGTCAATCACA,MG-R:GGCTTTATCATTGGCAAACG,NG-P:CAGACATCACGCACCGAAGCAT，CT-P:CCAAGCCGAGTCTACAGTTATAGGTCA， UU-P:ACCAACCATTGTATCTACACCTTCCATA,MH-P:CCACTCTTGACATCCTTCGCATA，和MG-P:CCATTCGCATCCAACTTCACCTCT。该混合物可以用于本发明的第一方面的方法中，也可以用于制备本发明第二和/或第四方面的试剂盒。本发明的有益效果在于能够五重检测样品中是否存在淋病奈瑟菌、沙眼衣原体、解脲支原体、人型支原体和生殖支原体，五重引物/探针无交叉污染及干扰，保证了的准确性、可靠性、特异性、灵敏度和重复性，而且使用目前常规的市售实时荧光PCR设备，无需改造，操作方便并节省成本，并且可以不使用内对照监控，进一步节约了成本。为了便于理解，以下将通过具体的附图、实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。另外，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。
图I显示了示例性的本发明实施例中对淋病奈瑟菌(NG)、沙眼衣原体(CT)、解脲 支原体(UU)、人型支原体(MH)、生殖支原体(MG)进行五重实时PCR的检测图谱，其结果曲线能够清晰区分。
具体实施例方式以下本文将通过具体的实施例来描述发明。如未特别指明之处，可根据本领域技术人员所熟悉的《分子可隆实验指南》(第三版)(Cold Spring Harbor laboratory Press)、《细胞实验指南》(科学出版社，北京，中国，2001年)、《RNA实验技术手册》(科学出版社，北京，中国，2004年)、《免疫检测技术》(科学出版社，北京，中国，1991)等实验手册以及本文所引用的参考文献中所列方法来实施。其中，所用的探针、引物可以委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成。实施例I核酸的提取淋病奈瑟菌(NG)、沙眼衣原体(CT)、解脲支原体(UU)、人型支原体(MH)和生殖支原体(MG)在许可条件下可购自国家卫生部临检中心，均为标准品，供核酸提取。核酸的提取按照常规磁珠提取法进行提取，为了同时适应上述五种微生物的核酸提取，改进如下向IuL标准品加入90uL核酸萃取液(配方及终浓度为异硫氰酸胍1.2M、乙二胺四乙酸钠(pH8. 0)10mM、吐温-20 2% (W/W)、高氯酸钠 1M、乙醇 40% (V/V)、Tris_HCl(pH8. 0)10mM)，于 42°C保温 lOmin，然后加入 IOuL MagDNA D-Beads DNA 磁珠悬浮液(50mg/mL，可购自北京艾比根生物技术有限公司)，振荡混合均匀后，套在磁架上施加磁场，弃去其中液体，然后加入200uL洗涤液A (配方及终浓度为高氯酸钠1M、乙醇30% (V/V))，洗涤后弃去洗涤液A，再加入200uL洗涤液B (配方及终浓度为乙醇70%(V/V))，洗涤后弃去洗涤液B，最后加入洗脱液(配方及终浓度为Tris-HCl ( 即.0)10禮)，于421保温IOminJl出并保留液体，即为核酸提取液。合并各微生物标准品的核酸提取液，并稀释供以下步骤测试。实施例2五重实时PCR测试I，引物及探针序列委托合成如下引物对和探针
检测淋病奈瑟菌的引物对NG-F:ACCGTAACGTCTCTAAGTCNG-R:GCAAGATTTCCGATTTGGC检测淋病奈瑟菌的探针NG-P:CAGACATCACGCACCGAAGCAT检测沙眼衣原体的引物对CT-F:TGTCCATATCTTTGATACGATCT-R:CTCTGATATTTGAAGACTCTACA 检测沙眼衣原体的探针CT-P:CCAAGCCGAGTCTACAGTTATAGGTCA检测解脲支原体的引物对UU-F:CTGCTCGTGAAGTATTACAUU-R:GTACCATCTGGGAAAGTAC检测解脲支原体的探针UU-P:ACCAACCATTGTATCTACACCTTCCATA检测人型支原体的引物对MH-F:TGTGGTTTAATTTGAAGATACATMH-R:AGTCCTCAACTTAATGTTAGA检测人型支原体的探针MH-P:CCACTCTTGACATCCTTCGCATA检测生殖支原体的引物对MG-F:AGGCAGTAATGTCAATCACAMG-R:GGCTTTATCATTGGCAAACG检测生殖支原体的探针MG-P:CCATTCGCATCCAACTTCACCTCT2，荧光标记在上述探针CT-P、NG-P、UU_P、MH-P和MG-P的5’端分别委托合成标记荧光标记FAM、VIC、NED、Texas Red和CY5，并在3’端标记相应的淬灭基团。3，PCR反应条件PCR反应体系总体积为20μ 1，其中各组分的终浓度分别为核酸提取液(100倍稀释)luL，上述5对引物对中的每一种引物含量为15pmol/ml，上述5种探针中的每一种含量增加至 8pmol/ml, Mg2+ (MgCl2)浓度为 3. 75mmoI /ml , dNTP 浓度各为 O. 2mmo1 /ml , UNG 酶含量为 O. 05U，2XPCR buffer (可购自 TaKaRa 公司，ρΗ8· 3，无 Mg2+)为 IOul，Taq DNA 聚合酶为2U，甘油15% (V/V)，余量为去离子水。反应热循环条件如下250C 5 分钟 94°C 10 分钟(940C 10 秒 55°C 15 秒 65°C 45 秒)X45 个循环使用ABI 7500实时荧光PCR仪，荧光采集FAM、VIC、NED、Texas Red和CY5检测波长。
4，结果判断基线和阈值设定为ABI 7500荧光仪默认自动设定。如果各荧光(FAM、VIC、NED、TexasRed或CY5)层Ct值大于45，则判定为相应微生物的核酸检测阴性，如果小于等于45，则判定相应微生物的核酸检测阳性。具体检测图谱见图15，表明本发明的方法能够检测极底浓度的上述微生物的靶核酸，而且检测互相不干扰，达到了超敏的检测灵敏度。以上测试重复120次(包括样品中只添加一、二、三或四种微生物标准品的核酸提取液，或者未添加任何提取液的情况，但是其他检测条件不变)，结果均正确，表明本发明准确性和可靠性好，无需内对照。序列表<110>苏州华益美生物科技有限公司〈120〉五重荧光PCR快速超敏检测试剂盒及其应用 〈130〉中国申请<160>15<170>PatentIn version 3.5<210>1<211>19<212>DNA〈213〉人工序列〈400〉Iaccgtaacgt ctctaagtc19<210>2<211>19<212>DNA〈213〉人工序列<400>2gcaagatttc cgatttggc19<210>3<211>21<212>DNA〈213〉人工序列<400>3tgtccatatc tttgatacga t21<210>4<211>23<212>DNA〈213〉人工序列<400>4ctctgatatt tgaagactct aca23<210>5
<211>19<212>DNA
〈2 13〉人工序列<400>5ctgctcgtga agtattaca19<210>6<211>19<212>DNA〈213〉人工序列<400>6gtaccatctg ggaaagtac19<210>7<211>23<212>DNA〈213〉人工序列<400>7tgtggtttaa tttgaagata cat23<210>8
<211>21<212>DNA〈213〉人工序列<400>8agtcctcaac ttaatgttag a21<210>9<211>20<212>DNA〈213〉人工序列<400>9aggcagtaat gtcaatcaca20<210>10<211>20<212>DNA〈213〉人工序列<400>10ggctttatca ttggcaaacg20<210>11<211>22<212>DNA〈213〉人工序列
〈400〉11cagacatcac gcaccgaagc at22<210>12〈211>27<212>DNA〈213〉人工序列<400>12ccaagccgag tctacagtta taggtca27·<210>13<211>28<212>DNA〈213〉人工序列<400>13accaaccatt gtatctacac cttccata28<210>14<211>23<212>DNA〈213〉人工序列〈400〉14ccactcttga catccttcgc ata23<210>15<211>24<212>DNA〈213〉人工序列<400>15ccattcgcat ccaacttcac ctct2权利要求
1.在单个PCR反应容器中五重检测核酸提取液中靶核酸的实时PCR方法，所述靶核酸来自淋病奈瑟菌、沙眼衣原体、解脲支原体、人型支原体和生殖支原体，其包括， (1)在所述单个PCR反应容器中混合核酸提取液、DNA聚合酶、dNTP、靶核酸引物对和靶核酸探针，其中所述探针标记有荧光基团和淬灭基团，而且各种探针标记的荧光基团的荧光检测波长互不相同，其中， 靶核酸引物对包括 ACCGTAACGTCTCTAAGTC,GCAAGATTTCCGATTTGGC,TGTCCATATCTTTGATACGAT,CTCTGATATTTGAAGACTCTACA,CTGCTCGTGAAGTATTACA,GTACCATCTGGGAAAGTAC，TGTGGTTTAATTTGAAGATACAT,AGTCCTCAACTTAATGTTAGA，AGGCAGTAATGTCAATCACA,和GGCTTTATCATTGGCAAACG, 靶核酸探针包括CAGACATCACGCACCGAAGCAT，CCAAGCCGAGTCTACAGTTATAGGTCA,ACCAACCATTGTATCTACACCTTCCATA,CCACTCTTGACATCCTTCGCATA,和CCATTCGCATCCAACTTCACCTCT ； (2)进行PCR反应，并实时检测不同波长的荧光；和， (3)根据荧光检测结果计算出的Ct值判断是否有靶核酸存在于样品中。
2.五重检测样品中淋病奈瑟菌、沙眼衣原体、解脲支原体、人型支原体和生殖支原体的方法，其包括， (A)提取样品中的核酸，获得核酸提取液；和， (B)对核酸提取液实施权利要求I所述的在单个PCR反应容器中五重检测样品中靶核酸的实时PCR方法。
3.权利要求I或2所述的方法，其是非诊断方法。
4.权利要求I所述的方法，其中各种探针标记有不同的荧光基团，优选荧光基团是FAM、VIC、NED、Texas Red 和 CY5。
5.权利要求I所述的方法，其中PCR反应的每个循环的条件为94°C10秒、55°C 15秒以及65°C 45秒。
6.权利要求I所述的方法，其中每种靶核酸探针在在所述单个PCR反应容器中的浓度大于5pmol/ml,优选为6 12pmol/ml,更优选为7 10pmol/ml,最优选为8pmol/ml。
7.权利要求2所述的方法，其中提取样品中的核酸是采用磁珠提取法提取的。
8.权利要求7所述的方法，其中提样试品中的核酸的过程是向样品加入核酸萃取液(优选核酸萃取液包含异硫氰酸胍、乙二胺四乙酸钠、吐温-20、高氯酸钠、乙醇和pH缓冲液(如，Tris-HCl))，保温后加入磁珠，混合均匀后，施加磁场后，弃去其中液体，然后洗涤(优选洗涤两次，更优选其中第一次洗涤所用的洗涤液包含高氯酸钠和乙醇，也更优选其中第二次洗涤所用的洗涤液包含乙醇)，并洗脱(优选洗脱所用的洗脱液包含PH缓冲液(如，TriS-HCl))ο
9.用于在单个PCR反应容器中五重检测核酸提取液中靶核酸的实时PCR方法的检测试剂盒，其包括DNA聚合酶、dNTP、靶核酸引物对和靶核酸探针，其中所述探针标记有荧光基团和淬灭基团，而且各种探针标记的荧光基团的荧光检测波长互不相同，其中， 靶核酸引物对包括 ACCGTAACGTCTCTAAGTC,GCAAGATTTCCGATTTGGC,TGTCCATATCTTTGATACGAT,CTCTGATATTTGAAGACTCTACA,CTGCTCGTGAAGTATTACA,GTACCATCTGGGAAAGTAC，TGTGGTTTAATTTGAAGATACAT,AGTCCTCAACTTAATGTTAGA， AGGCAGTAATGTCAATCACA,和 GGCTTTATCATTGGCAAACG, 靶核酸探针包括CAGACATCACGCACCGAAGCAT，CCAAGCCGAGTCTACAGTTATAGGTCA,ACCAACCATTGTATCTACACCTTCCATA, CCACTCTTGACATCCTTCGCATA,和 CCATTCGCATCCAACTTCACCTCT。
10.权利要求9所述的试剂盒，其中各种探针标记有不同的荧光基团，优选荧光基团是FAM、VIC, NED、Texas Red 和 CY5。
11.权利要求9所述的试剂盒，其中每种靶核酸探针在在所述单个PCR反应容器中的浓度大于5pmol/ml,优选为6 12pmol/ml,更优选为7 10pmol/ml,最优选为8pmol/ml。
12.用于五重检测样品中淋病奈瑟菌、沙眼衣原体、解脲支原体、人型支原体和生殖支原体的检测试剂盒，其包括权利要求扩11之任一所述的试剂盒和磁珠提取法所需试剂。
13.权利要求12所述的试剂盒，其中磁珠提取法所需试剂包括， 核酸萃取液，优选核酸萃取液包含异硫氰酸胍、乙二胺四乙酸钠、吐温-20、高氯酸钠、乙醇和PH缓冲液(如，Tris-HCl)； 第一次洗涤所用的洗涤液，优选其包含高氯酸钠和乙醇； 第二次洗涤所用的洗涤液，优选其包含乙醇；和， 洗脱所用的洗脱液，优选其包含PH缓冲液(如，Tris-HCl)。
14.权利要求扩11之任一所述的试剂盒在制备用于在单个PCR反应容器中五重检测核酸提取液中靶核酸的实时PCR方法的检测试剂产品(优选是用于权利要求1-8之任一所述的方法的检测试剂产品)中的应用。
15.权利要求12或13所述的试剂盒在制备用于五重检测样品中淋病奈瑟菌、沙眼衣原体、解脲支原体、人型支原体和生殖支原体的检测试剂(优选是用于权利要求2、7或8所述的方法的检测试剂产品)中的应用。
16.互不干扰实时PCR的核酸混合物，其是引物或探针的混合物，所述引物或探针选自 ACCGTAACGTCTCTAAGTC,GCAAGATTTCCGATTTGGC,TGTCCATATCTTTGATACGAT,CTCTGATATTTGAAGACTCTACA,CTGCTCGTGAAGTATTACA,GTACCATCTGGGAAAGTAC，TGTGGTTTAATTTGAAGATACAT,AGTCCTCAACTTAATGTTAGA，AGGCAGTAATGTCAATCACA，GGCTTTATCATTGGCAAACG,CAGACATCACGCACCGAAGCAT，CCAAGCCGAGTCTACAGTTATAGGTCA,ACCAACCATTGTATCTACACCTTCCATA, CCACTCTTGACATCCTTCGCATA,和 CCATTCGCATCCAACTTCACCTCT。
全文摘要
本发明涉及在单个PCR反应容器中五重检测核酸提取液中靶核酸的实时PCR方法，用于检测样品中淋病奈瑟菌、沙眼衣原体、解脲支原体、人型支原体和生殖支原体。
文档编号C12Q1/04GK102888464SQ20121041093
公开日2013年1月23日 申请日期2012年10月25日 优先权日2012年10月25日
发明者陈悦科, 张文艳, 刘明霞, 叶成果, 王奕江, 沈靖 申请人:苏州华益美生物科技有限公司