所示(可通过基因合成的方法获得111(：1〇代"的0嫩序 列)。
[0096] 图3a显示了 mClover3、dClover2和Clover的蛋白质一级结构的序列及对比结果。 形成生色团的氨基酸已经用黑色方框标出。位于蛋白壁上的三处突变(N149，G160，A206)用 橙色标出。图3b显示了mClover3与Clover相比突变位点的晶体结构。图3c显示了绿色焚光 蛋白mEGFP、Envy、mNeonGreen、Clover和Clover3的吸收光谱（左图）和发射光谱（右图），可 以看出mClover3与Clover相比拥有相似的光谱，并且在亮度上也差不多。另mClover3在体 内时在亮度归一化情况下光稳定性的半衰期为80秒。
[0097] 2 · 2mCl〇Ver3在哺乳动物细胞系中成像
[0098]在哺乳动物细胞系中对mCl〇Ver3系统性地进行了测试。
[0099]图4a显示了在HeLa细胞中表达mCl〇Ver3融合蛋白后对特定的亚细胞结构的荧光 成像图。从左到右:1^1〇￥613-733-3(：1：；[11(肌动蛋白细胞骨架），111(]1〇￥613-633-1：1113111；[11(微 管），connexin43(细胞粘附接点）-7aa_mClover3，mClover3-10aa_H2B(核小体）。中间aa代 表连接两个蛋白之间的距离的单位，以单个氨基酸距离为1个aa。证明了 mRuby3的融合蛋白 能够准确的与哺乳动物细胞系中的重要的亚细胞目标区域相结合。然后将mRuby和mRuby3 在哺乳细胞内所产生的荧光信号与其它的单体的绿色荧光蛋白进行比较，如mEGFP、sfGFP 和Envy mEGFP是现在用途最广泛的荧光蛋白。sfGFP是mEGFP的具有高折叠效率的衍生体。 而Envy在出芽酵母中被认为是亮度最大的。但是，这三种蛋白在体外提取物中都没有 Clover和mCl0Ver3亮度大(表1)。但是在哺乳动物细胞系中表现出相似的亮度。而最近报道 的单体mNeonGreen在体外相比mClover3要亮10% (表1)，二者有着相似的激发和发射光谱， 与绿色荧光蛋白（GFP)相比出现了少许的红移，可能是荧光生色团出现了阳离子-π相互作 用。
[0100] 在HEK293A和HeLa细胞中通过表达GFP-P2A-mCherry，比较了六种单体绿色荧光蛋 白的亮度，结果参见图4b。发现在HEK293A细胞中，转染了mNeonGreen的细胞平均荧光强度 是最亮的，其次是Clover或mClover3，再次是Envy，最弱的是sfGFP。mNeonGreen和 mClover3、mClover3和EGFP或sfGFP之间的差异具有统计学意义(p〈0.05)。在HeLa细胞中， mNeonGreen、Clover或mClover3表达后都出现很强的焚光，相互之间亮度差别不大，而Envy 的亮度次之，然后是EGFP，最后是奸6??。111(：1(^虹3』11"46??和奸6??之间的亮度差异有统 计学意义。
[0101] 为了寻找最适合的可以做mRuby3的荧光共振能量转移最佳供体的单体绿色荧光 蛋白，将要检测的单体的绿色焚光蛋白mClover、mClover3、mNeonGreen和EGFP与mRuby3做 成融合蛋白，然后在哺乳动物细胞中检测各种融合蛋白的荧光共振能量转移的效率，结果 见图4c，显示实验所得的发射光光谱(红色线)与线性拟合的发射光光谱(黑色线)十分的吻 合，mCl over 3和mNeonGreen相比与mEGFP拥有更高的焚光共振能量转移效率。mClover3_ mRuby3和mNeonGreen_mRuby3的效率也比Clover_mRuby3要高（图4c)。由此可见，mClover3 和mNeonGreen是mRuby 3的最有效的供体。
[0102] 3Camuia 传感器
[0103] 首先分别构建以 Clover 和 mRuby3 为 FRET 对的 Camuia-CR3，mClover3 和 mRuby3 为 FRET 对的 Camuia-C3R3 ,mNeonGreen 和 mRuby3 为 FRET 对的 Camuia-NR3 〇
[0104] 图5a显示与Camuia连接的绿色/红色FRET对的结构。实验证明在检测CaMKIIa的活 性时，Cl〇Ver3-mRuby3提高了荧光共振能量转移的灵敏度。在Camuia实验中，荧光蛋白与 CaMKIIa多肽的终端相融合形成FRET对。与结构分析相一致，Camuia在不活跃状态下FRET能 力高，在活化状态下FRET能力低（图5a)。
[0105] 然后测试在Camuia指示器中新的红色和绿色荧光蛋白在提高FRET基线的能力。图 5b显示了绿色/红色表达Camuia的HeLa细胞在没有钙离子载体刺激的情况下供体/受体的 发射比率（RDA)，显示含有mRuby3的Camuia-CR3的FRET基线比含有mRuby2的Camuia-CR高 (图5b)。仅仅将Clover替换为mClover3或mNeonGreen不能明显的改变基本的FRET水平（图 5b)。数据以均值土标准差形式表现。
[0106] 最后检测Camuia本身效果是否会因为新的FRET对的出现有所提升。在钙离子载体 的刺激下，在HeLa细胞中比较Camuia-CR、-CR3、-C3R3和-NR3的反应。图5c的左图为平均供 体/受体的发射比率(RDA)随时间的变化图，右图为HeLa细胞在钙离子载体刺激下反应所得 到的强度比率图。每个细胞的发射比率的变化在图中用灰色线表示，平均值用黑色线表示。 数据以均值土标准差形式表现。将Camuia-CR分别与Camuia-C3R3和Camuia-NR3在激发峰值 处的比率有统计学差异。Camuia-CR3的平均反应与Camuia-CR相似，大约在45% (图5c)。如 果将mClover3和mNeonGreen取代Clover将会显著地提高Camuia动态范围，|丐诱导的增强提 高了绿色/红色发射比率。在Camuia-CR3中提高了45%，在Camuia-C3R3中提高了70%，在 Camuia-NR3中提高了 56 % (图5c)。虽然Camuia-CR3、-C3R3和-NR3拥有相似的ro值和FRET基 线，但是Camuia的敏感性出现了显著的提升。如果mNeonGreen或mClover3出现了 149位由N 变成Y和第206位由A变成K两个位置突变，会促进Camuia-C3R3和Camuia-NR3向活化状态转 变。
【主权项】
1. 一种红色荧光蛋白，该红色荧光蛋白的氨基酸序列与mRuby2的氨基酸序列相比，具 有以下突变位点:M160I; 优选地，该红色荧光蛋白的氨基酸序列与mRuby2的氨基酸序列相比，还具有以下突变 位点：N33R，M36E，T38V，K74A，G75D，M105T，C114E，H118N，Q120K，H159D，S171H，S173N， I192V，L202I，M209T，F210Y，H216V，F221Y，A222S，G223N 中的一个或多个的组合。2. 根据权利要求1所述的红色荧光蛋白，其为选自以下(a)或(b)的蛋白： (a) 具有如SEQ ID No.2所不氣基酸序列的蛋白； (b) 在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且与(a)具有 相同功能的由（a)衍生的蛋白。3. -种绿色荧光蛋白，该绿色荧光蛋白的氨基酸序列与Clover的氨基酸序列相比，具 有以下突变位点:N149Y; 优选地，该绿色荧光蛋白的氨基酸序列与Clover的氨基酸序列相比，还具有以下突变 位点:G160S 或 G160C; 更优选地，该绿色荧光蛋白的氨基酸序列与Clover的氨基酸序列相比，还具有以下突 变位点：A206K。4. 根据权利要求3所述的绿色荧光蛋白，其为选自以下(a)或(b)的蛋白： (a) 具有如SEQIDNo.4、SEQIDNo.5或SEQIDNo.6所示氨基酸序列的蛋白； (b) 在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且与(a)具有 相同功能的由（a)衍生的蛋白。5. 编码权利要求1或2所述的红色荧光蛋白、或者权利要求3或4所述的绿色荧光蛋白的 多核苷酸序列； 优选地，所述多核苷酸序列具有如SEQ ID No. 1、或SEQ ID No.3所示序列。6. -种融合蛋白，其包含权利要求1或2所述的红色荧光蛋白、或者权利要求3或4所述 的绿色荧光蛋白。7. 权利要求1或2所述的红色荧光蛋白在作为荧光共振能量转移受体中的应用； 优选地，其中，所述焚光共振能量转移的供体选自以下蛋白：mEGFP、Envy、mNeonGreen、 Clover或权利要求3或4所述的蛋白。8. 权利要求3或4所述的绿色荧光蛋白在作为荧光共振能量转移供体中的应用； 优选地，其中，所述焚光共振能量转移的受体选自以下蛋白：mCherry、mKate2、 Fus ionRed、mRuby2或mRuby3 〇9. 一种能用于荧光共振能量转移成像的蛋白对，其包括： 权利权利要求1或2所述红色荧光蛋在作为荧光共振能量转移受体;和/或 权利要求3或4所述的绿色荧光蛋白作为荧光共振能量转移供体。10. -种可用于光学成像的基因编码生物传感器，该生物传感器包括： 权利权利要求1或2所述红色荧光蛋白作为荧光共振能量转移受体;和/或 权利要求3或4所述的绿色荧光蛋白作为荧光共振能量转移供体。
【专利摘要】本发明提供了可用于高灵敏FRET成像的荧光蛋白对及其应用。具体而言，本发明提供了一种红色荧光蛋白，该红色荧光蛋白的氨基酸序列与mRuby2的氨基酸序列相比，具有以下突变位点：N33R,M36E,T38V,K74A,G75D,M105T,C114E,H118N,Q120K,H159D,M160I,S171H,S173N,I192V,L202I,M209T,F210Y,H216V,F221Y,A222S,G223N。本发明还提供了一种绿色荧光蛋白，该绿色荧光蛋白的氨基酸序列与Clover的氨基酸序列相比，具有以下突变位点：N149Y,G160S或G160C,A206K。本发明的红色荧光蛋白和绿色荧光蛋白具有良好的光稳定性，可用于高灵敏FRET成像。
【IPC分类】C12N15/11, C07K14/00, C12Q1/02
【公开号】CN105504027
【申请号】CN201511025610
【发明人】储军, 郭育奇, 张楚秋, 王慧娜
【申请人】深圳先进技术研究院
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2015年12月31日