洗脱流度为0.5毫升/分钟。通过280nm处的吸收监测蛋白洗脱。
[0067] (6)基础荧光共振能量转移的测量
[0068] GFP-RFP融合蛋白由C-端截断的av GFP衍生体或mNeonGreen通过连接序列融合了 mRuby2或mRuby3的aa 3-233。将融合蛋白转染到HEK293A和HeLa细胞中。转染后2天，将细胞 转移到96孔板中检测荧光光谱。发射光谱范围为490-750nm，用470nm激发。
[0069] (7)在哺乳动物细胞系中比较突变体的光亮度
[0070] 对哺乳动物细胞系中绿色荧光蛋白和mRuby的突变体进行比较时，以mCherry和 mTurqu〇iSe2为表达内参，使用脂质体法转染重组质粒到HEK293A和HeLa细胞中，转染后2 天，将细胞转移到底部透明的96孔板中检测荧光光谱。不同的荧光蛋白的设置参数如下： mTurquoi se2-434/5nm_474/5nm，mCherry-587/20nm-610/5nm，GFP-430/20nm-480~650nm， RFP-550/10nm-570~670nm。相对亮度是以整合的绿色荧光蛋白或mRuby突变体发射光强除 以mCherry或mTurquo i s e2的发射光强得到的。
[0071] (8)Camuia传感器改进和特征
[0072] 为了构建Camuia-CR突变体，一个N-末端为Nhe頂每切位点和一个C-末端扩展编码 的连接器(GFP和CaMKIIa之间的）被用来扩增C-末端截短的avGFP(不含'GITHGMDELYK'序 列）或mNeonGreen(不含' GMDELYK '序列）。在任意一端的CaMKI Ia区域通过PCR扩增成功后， 对mRuby2或mRuby3也通过PCR方法扩增目的片段，反应同时在CaMKIIa区域引入一个N-末端 扩展的连接器，在C-末端引入Apa頂每切位点，通过重叠延伸聚合酶链式反应将插入片段克 隆到载体pcDNA3.1上。
[0073]在细胞被重组质粒转染后2天，用显微镜观察细胞。使用倒置荧光显微镜200M的冷 ORCA-ER CCD摄像机和40X 1.2-NA C-高度消色镜水浸模块观察，使用软件Micro-manager 1.4,具体参数为：17-inch 2.5-GHz Core 2Duo MacBook Pro running Mac OS 10.6.8。连 续不断的FRET和供体发射光谱成像通过以下滤光片获得:绿色荧光蛋白为激发HQ470/30nm 和发射505AELP nm，FRET使用激发HQ470/30nm和发射BA575IF nm〇
[0074] (9)比率型图像分析
[0075] FRET的测量通过软件ImageJ量化。原始文件为16-位TIFF文件，以随机的方法来选 择视野，转染发出荧光细胞为阳性，以未转染的细胞为背景检测。背景去掉供体的发射强度 除以背景去掉FRET的强度得到的值为发射比率。使用一个全光谱查阅表(最小值为蓝色，最 大值为红色），通过受体通道产生强度调节显示。
[0076] (1〇)统计方法
[0077]采用方差分析和邓尼特法后验检测确定细胞中亮度测量的差异。采用T检验确定 Camuia突变体的峰值发射比率改变有没有统计学差异。作图软件为Excel和Prism。
[0078] 实施例1:可用于高灵敏FRET成像的荧光蛋白对
[0079] 1新红色焚光蛋白mRuby 3的性质和成像效果
[0080] l.lmRuby3的结构和光物理性质
[00811采用定点突变技术在mRuby2基础上进行定点诱变获得本发明的新红色荧光蛋白 mRuby Sc3IiiRuby 3的氨基酸序列参见SEQ ID No.2所示，本发明设计的优选的编码该蛋白 mRuby 3的基因序列参见SEQ ID No. 1所示（可通过基于PCR聚合的基因合成方法获得 mRuby3的DNA序列，即设计很多PCR引物，每两个引物存在18~25bp的重叠，然后通过 overlap PCR的方法将所有引物聚合，从而行程一个完整的基因）。
[0082] mRuby 3与上一代的mRuby2相比氨基酸序列有21个替换，具体为：N33R，M36E， T38V，K74A，G75D，M105T，C114E，H118N，Q120K，H159D，M160I，S171H，S173N，I192V，L202I， 12091'^210￥，!1216￥^221￥，厶2225,62231可参见图13，而1111^^的晶体结构(？08数据库10 为3U0M)可参见图lb。图Ia中，形成生色团的氨基酸已经用黑色方框标出；位于蛋白外壁的 突变用蓝色标出，包括N33R，T38V，M105T，C114E，H118N，Q120K，H159D，S171H，S173N，L202I, F210Y，H216V;位于内壁的突变用绿色标出，包括:M160I;位于环处的突变用橙色标出，包 括：M36E，K74A，G75D，I192V，M209T，F221Y，A222S，G223N。
[0083] 红色焚光蛋白mCherry、mKate 2、FusionRecUmRuby 2、和mRuby 3的吸收图可参见图 Ic中左图，各蛋白发射图可参见图Ic中右图。图中可见，mRuby3的激发光谱和发射光谱的峰 值分别在558nm和592nm处，与mRuby2相比出现了蓝移。在峰值处的消光系数为128mM- 1Cnf1, 量子产率为0.45 (见表1)，所以mRuby3的光强度比mRuby2高出35 %，所以它是目前为止最亮 的单体红色焚光蛋白。除此之外，mRuby3的光稳定性很好，在弧光灯的照射下，mRuby3的半 衰期为349秒，长于mRuby2的123秒和TagRFP-T的337秒。在光漂白动力学方面，mRuby3表现 出单指数关系，它的解离常数值为4.8，与mRuby2相比耐酸性相似。所以mRuby3是目前为止 亮度最亮和光稳定最好的红色荧光蛋白。
[0084] 表1:单体绿色和红色荧光蛋白的光物理性质
[0087]表注:b为激发光峰值时所在的波长。c为发射光峰值时所在的波长。d为最大消光 系数。e为荧光量子产率。f为蛋白光亮度的相对值。g为解离常数。h为蛋白的光稳定性，表示 在弧光灯照射下每个分子每秒从1000个光子光漂白为500个光子所用的时间，时间单位为 秒。
[0088] mRuby 3与mRuby2相比的各突变位点中，M160I让蛋白更亮，但蛋白成熟或折叠变 差;而其它位点则让蛋白成熟或折叠变好。在本发明中，还在mRuby2的基础上定点突变得到 了与mRuby2相比仅具有M160I突变位点的突变体，本发明中命名为mRuby2-M160I。图Id中的 图片（1)显示了 mRuby2(右边)和mRuby2-M160I(左边)突变体在细菌培养箱中过夜培养24h 的荧光图，图Id中的图片（2)显示了mRuby2(右边)和mRuby2-M160I(左边)突变体在细菌培 养箱中培养48h的荧光图。从图中可知，mRuby2-M160I由于成熟或折叠比较慢，因此24h培养 后比mRuby2要暗一些，但随着培养时间的延长，最终要比mRuby2要亮。图Id中的图片（3)为 mRuby3和mRuby2在细菌培养箱中过夜培养24h后的荧光图（图中左边为mRuby3,右边为 mRuby2)〇
[0089] 1.2mRuby3在哺乳动物细胞系中成像
[0090]在哺乳动物细胞系中比较突变体的光亮度。图2a为在HeLa细胞中表达mRuby3融合 蛋白后对特定的亚细胞结构的焚光成像图。从左到右:mRuby3-7aa_actin(肌动蛋白细胞骨 架），mRuby3-6aa_tubulin(微管），connexin43(细胞粘附接点）-7aa_mRuby3，mRuby3_10aa- H2B(核小体）。中间aa代表连接两个蛋白之间的距离的单位，以单个氨基酸距离为1个aa。证 明了mRuby3的融合蛋白（PCR扩增获得mRuby3序列，然后将此连接入EcoRI和BglII双酶切的 pEGFP-Cl载体中构建pmRuby3-Cl，然后分别扩增上诉亚细胞定位序列，然后通过in-fusion 技术连入BamHI和EcoRI双酶切的pmRuby3-Cl载体中构建融合蛋白）能够准确的与哺乳动物 细胞系中的重要的亚细胞目标区域相结合。
[0091] 然后将mRuby3在哺乳细胞内所产生的荧光信号与其它的单体的红色荧光蛋白进 行比较。图2b显示了在HEK293A和HeLa细胞中四种单体红色焚光蛋白mCherry、FusionRed、 mRuby2和mRuby3的亮度比较，结果显示mRuby3在HEK293A和HeLa细胞中所表达的信号强度 最强，比红色焚光蛋白mRuby2、FusionRed和mCherry高出至少100% (图2b)。本发明的这种 检测方法得到的结果与单独每个分子光亮度检测方法相比灵敏度更高。
[0092] 由此可见，mRuby3理论上是一个FRET的优秀受体。由于mRuby2已经证明是一个高 效的荧光共振能量转移受体。所以将mRuby3与mRuby2进行比较，以相同的绿色荧光蛋白 Clover为供体，发现mRuby3比mRuby2更高效。
[0093] 2新绿色焚光蛋白mClover3的性质和成像效果
[0094] 2. lmClover3的结构和光物理性质
[0095] 本发明中同样还对绿色荧光蛋白Clover进行了改造，意图得到一个光亮度和光稳 定性有所提升且可以作为mRuby3荧光共振能量转移高效供体的蛋白。通过随机突变技术 (米用Clontech公司的GeneMorph II Random Mutagenesis试剂盒进行，保证1~3bp突变/ 1000 bp)得到Clover的突变体，然后通过蓝色发光二极管的照射筛选光稳定性强的突变体。 经过筛选得到Cl〇verl.5(第149位由天冬酰胺变成酪氨酸），dCl 〇ver2(第149位由天冬氨酸 变成酪氨酸，第160位由甘氨酸变成丝氨酸）。在体内，dCloverf在亮度归一化情况下光稳定 性的半衰期为98秒，而Clover只有50秒。消光系数为也比Clover的lllmM _1cm_1 有所提高。相对量子产率为0.8比Clover的0.76稍高。在dClover2的基础上进一步经过将第 206位点处丙氨酸变为赖氨酸和将160位点处丝氨酸变半胱氨酸后，得到了单体的荧光蛋白 mClover3。mClover3的氨基酸序列参见SEQIDNo.4所示，本发明设计的优选的编码该蛋白 mClover3的基因序列参见SEQ ID如.3