剧烈震荡后室 溫静置4min，然后4°C，12000巧m离屯、4min。
[0040] 3、将上清液置于另一离屯、管中，向上清液中加0.15mL氯仿，盖紧离屯、管，用手剧烈 摇荡15s后，室溫静置4min，然后4°C，13000巧m离屯、5min。
[0041] 4、将上清液转移至另一离屯、管中，加等体积的4°C异丙醇，上下颠倒摇匀，-20°C静 置 4min，然后 4°C，13000巧m 离屯、5min。
[0042] 5、弃去上清液，RNA沉淀用0.5血75%乙醇冲洗2次，然后4°C，13000rpm离屯、4min; 弃去上清液，RNA沉淀再用0.5mL无水乙醇冲洗1次，然后4°C，13000巧m离屯、4min;去除乙醇， RNA置于超净工作台室溫干燥3-5min(注意不要过分干燥），然后用不含RNA酶的灭菌水90化 溶解，-80°C保存。
[0043] 实施例3乌塌菜总RNA的高效提取方法
[0044] 1、取乌塌菜新鲜嫩叶0.1 mg，剪碎后，分2-3次加入15mL液氮，在3min内将叶片研磨 成粉末，倒入离屯、管中，操作在超净工作台上完成(避风环境）。
[0045] 2、向上述粉末中加入ImL化izol裂解液，将离屯、管置于旋窝机中剧烈震荡后室溫 静置5min，然后4°C，12000巧m离屯、5min。
[0046] 3、将上清液置于另一离屯、管中，向上清液中加0.3mL氯仿，盖紧离屯、管，用手剧烈 摇荡30s后，室溫静置3min，然后4°C，13000巧m离屯、15min。
[0047] 4、将上清液转移至另一离屯、管中，加等体积的4°C异丙醇，上下颠倒摇匀，-20°C静 置 3min，然后 4°C，13000巧m 离屯、15min。
[004引 5、弃去上清液，RNA沉淀用1.0血75%乙醇冲洗2次，然后4°C，13000rpm离屯、3min; 弃去上清液，RNA沉淀再用1.5mL无水乙醇冲洗1次，然后4°C，13000rpm离屯、3min;去除乙醇， RNA置于超净工作台室溫干燥3-5min(注意不要过分干燥），然后用不含RNA酶的灭菌水80化 溶解，-80°C保存。
[0049] 实施例4不同RNA提取方法的效果比较
[0050] 取0.1 g乌塌菜新鲜嫩叶，分别使用实施例1 -3的高效提取法、普通Tri ZO1提取法 (参见白菜抽臺性相关序列的克隆与分析，邹艳敏，首都师范大学，2009)?及植物总RNA提 取试剂盒(TIANGEN:RNA simple Total RNA Kit)S种方法提取乌塌菜叶片总RNA。
[0051] 实验结果见表1和图1，结果表明，本发明的乌塌菜总RNA的高效提取法较其他两种 方法提取的乌塌菜叶片基因组RNA产率和纯度高，且RNA无降解。
[0化2] 表种方法提取RNA结果比较 [0化3]
[0化4] 注:a、b、c、d、e分别表示在0.05水平下的显著性差异。
[0055]虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可W对之作一些修改或改进，运对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的运些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 乌塌菜总RNA的高效提取方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 取乌塌菜叶片加入液氮快速研磨成粉末，倒入离心管中； 2) 向上述粉末中加入Trizol裂解液，将离心管置于旋窝机中震荡后室温静置，然后4°C 离心； 3) 将上清液置于另一离心管中，向上清液中加氯仿，震荡后室温静置，然后4°C离心； 4) 将上清液转移至另一离心管中，加异丙醇上下颠倒摇匀，-20°C静置后，4°C离心； 5) 弃去上清液，用不同浓度的乙醇洗RNA沉淀，4°C离心，弃去上清液，RNA置于超净工作 台室温干燥后，用不含RNA酶的灭菌水溶解，-80°C保存。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)具体为:取乌塌菜叶片O.lmg，剪碎 后，分2-3次加入15-20mL液氮，在3-5min内将叶片研磨成粉末，操作在超净工作台上完成。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)具体为：向步骤1)的粉末中加入1-1.5mL Trizol裂解液，将离心管置于旋窝机中震荡后室温静置3-5min，然后4°C，12000rpm 离心 3_5min。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)具体为:将步骤2)所得上清液置于 另一离心管中，向上清液中加0.15-0.3mL氯仿，盖紧离心管，用手摇荡15-30s后，室温静置 3_5min，然后 4°C，13000rpm 离心 5_15min。5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)具体为:将步骤3)所得上清液转移 至另一离心管中，加等体积的4°C异丙醇，上下颠倒摇匀，_20°C静置3-5min，然后4°C， 13000rpm 离心 5_15min。6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5)具体为：弃去上清液，RNA沉淀用 0.5-1. OmL 75 %乙醇冲洗2次，然后4°C，13000rpm离心3-5min;弃去上清液，RNA沉淀再用 0.5-1.5mL无水乙醇冲洗1次，然后4°C，13000rpm离心3-5min;去除乙醇，RNA置于超净工作 台室温干燥5-10min，然后用不含RNA酶的灭菌水80-100yL溶解，-80°C保存。7. 根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 取乌塌菜叶片0. lmg，剪碎后，分2-3次加入20mL液氮，在3min内将叶片研磨成粉末， 倒入离心管中，操作在超净工作台上完成； 2) 向上述粉末中加入lmL Trizol裂解液，将离心管置于旋窝机中震荡后室温静置 3min，然后 4°C，12000rpm 离心 5min; 3) 将上清液置于另一离心管中，向上清液中加0.2mL氯仿，盖紧离心管，用手摇荡20s 后，室温静置5min，然后4°C，13000rpm离心10min; 4) 将上清液转移至另一离心管中，加等体积的4°C异丙醇，上下颠倒摇匀，_20°C静置 5min，然后 4°C，13000rpm离心 lOmin; 5) 弃去上清液，RNA沉淀用0.8mL 75 %乙醇冲洗2次，然后4°C，13000rpm离心5min;弃去 上清液，RNA沉淀再用1. OmL无水乙醇冲洗1次，然后4°C，13000rpm离心5min;去除乙醇，RNA 置于超净工作台室温干燥3_5min，然后用不含RNA酶的灭菌水80yL溶解，-80°C保存。
【专利摘要】本发明涉及乌塌菜总RNA的高效提取方法，通过向乌塌菜叶片中加入液氮研磨、提高离心转速、使用不同浓度乙醇洗涤RNA沉淀等操作，可实现高纯度高浓度、且无降解的乌塌菜总RNA的提取。本发明首次提供一套科学系统地从乌塌菜叶片中提取总RNA的方法，不仅提高了提取效率，又可有效避免提取过程中的污染，导致RNA降解，采用本方法仅需50-55min即可完成乌塌菜总RNA的提取，获得的高纯度高浓度无降解的总RNA，有利于后续研究的深入。
【IPC分类】C12N15/10
【公开号】CN105543215
【申请号】CN201610087704
【发明人】汪承刚, 方柔, 刘思嘉, 陈国户, 袁凌云, 朱世东, 葛继涛
【申请人】安徽农业大学
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2016年2月16日