末端缀合于接头。
[0063] 核酸可为任意长度。其长度可根据复合物的最终用途来指定。因此，在一些情况 下，当需要较短的核酸时，所述核酸可W是长度在1-1000、1-500、1-100、1-50的范围内或其 间的任何范围内的寡核巧酸。所述核酸可天然存在或非天然存在。可从天然来源，或通过使 用例如自动化寡核巧酸合成仪合成来制备其。所述核酸可包含天然存在的核巧酸或非天然 存在的核巧酸。它们可包含天然存在的主链键联或非天然存在的主链键联。所述核酸可包 含DNA或由DNA组成。
[0064] 目标蛋白质可W实际上是任何蛋白质，包括天然存在的蛋白质和非天然存在的蛋 白质(诸如例如工程蛋白质）。所述蛋白质可天然地含有分选酶祀序列（其实例为LPETGn(氨 基至簇基序列）（或GnTE化簇基至氨基序列（SEQ ID N0:4))。另一个实例为LPETGGG序列 (SEQ ID N0:5)。所述蛋白质可附接于LPXTGn序列，包括LPETGn序列（分别为SEQ ID N0:17和 SEQ ID N0:4)，包括LPETGGG(氨基至簇基）序列（SEQ ID N0:5))。运些序列的取向示于图 中。该附接可在合成后或在合成过程中发生。所述蛋白质可W是抗体、包含抗原结合抗体片 段的抗体片段、细胞粘附蛋白诸如CAM、整联蛋白、巧粘蛋白等、转录因子、配体受体、配体、 信号转导蛋白、激素、细胞因子、白细胞介素、趋化因子等。
[0065] 本公开内容从而提供了包括将核酸与包含一个或多个且优选至少3个连续甘氨酸 残基的肤反应的方法。在一些实施方案中，使用生物正交铜（I)催化的点击化学反应使核酸 与肤反应。在一些实施方案中，所述核酸包含叠氮化物并且所述肤包含烘控。或者，所述核 酸可包含烘控并且所述肤可包含叠氮化物。在另一个实施方案中，可使用横基班巧酷亚胺- 4-(N-马来酷亚胺甲基)环己烧-1-簇酸醋(SMCC)将含脫氨酸的肤与胺官能化的寡核巧酸反 应。除了甘氨酸W外，所述肤还可包含纯化标签和位于纯化标签与甘氨酸之间的可切割的 氨基酸序列。所述纯化标签可W是化S-标签或Flag序列（或Flag-标签）。所述可切割的氨基 酸序列可W是酶可切割的氨基酸序列诸如TEV酶祀序列。所述方法产生缀合于肤的核酸，和 从而缀合于至少甘氨酸及任选地缀合于纯化标签和可切割的序列的核酸。该缀合物在本文 中可被称为核酸-肤缀合物。所述方法还可包括从反应混合物分离核酸-肤缀合物。运样的 分离可包括释放的Cu(I)和未偶联的肤的去除和/或偶联的寡核巧酸经由纯化标签的正选 择。所述正选择可使用亲和方法诸如包含针对所述纯化标签的结合伴侣的珠粒、柱子、浆体 等来实现。运样的结合伴侣可W是抗体或抗体片段。分离后，所述核酸-肤缀合物可在切割 序列上被切割W释放纯化标签。运可通过将核酸-肤缀合物与酶诸如TEV蛋白酶反应来实 现。所述核酸-肤缀合物随后将包含缀合于甘氨酸(其现在可接近分选酶)的核酸。随后如下 所述，将缀合物与分选酶可接近的蛋白反应。
[0066] 本公开内容还提供了方法，所述方法包括在分选酶存在的情况下将：
[0067] (1)将缀合于包含1个或多个(包括3个)末端甘氨酸(G)残基的氨基酸序列的核酸 与
[0068] (2)缀合于LPXTGX'n(SEQ ID顯:2)的末端氨基酸序列的蛋白质反应，其中乂和乂' 是任何独立选择的氨基酸并且η为大于0的数值或大于0的数值的范围，
[0069] W形成包含通过具有LPXTGGG(N至C)或GGGTX化(C至NKSEQ ID Ν0:9)的氨基酸序 列的氨基酸接头共价缀合于所述蛋白质的核酸的复合物。在一些实施方案中，V'为大于1 的数值。
[0070] 在一些实施方案中，所述方法包括在分选酶存在的情况下将
[0071] (1)缀合于包含一个或多个(包括3个)末端甘氨酸(G)残基的氨基酸序列的核酸与
[0072] (2)缀合于具有LPETGXn(SEQ ID Ν0:3)的末端氨基酸序列的蛋白质反应，其中X为 氨基酸并且η为大于0的数值或大于0的数值的范围，
[0073] W形成包含通过具有LPETGGG(N至C)或GGGTE化(C至N)(SEQIDN0:5)的氨基酸序 列的氨基酸接头共价缀合于蛋白质的核酸的复合物。在一些实施方案中，V'为大于1的数 值。
[0074] 分选酶和末端氨基酸可各自包含纯化标签诸如但不限于化S-标签。
[0075] 所述方法还可包括分离包含共价地缀合于蛋白质的核酸的复合物。运样的分离可 通过使用亲和方法诸如本文所述的那些方法除去包含纯化标签(优选相同的纯化标签）的 反应组分来实现。通常地，存在于分选酶祀序列中的任何纯化标签将在分选酶转位发生后 被除去。因此，所述最终的核酸-蛋白质产物将在针对纯化标签的选择后存在于上清液中。
[0076] 如上所述，可使用例如如本文中举例说明的生物正交铜催化的点击化学反应合成 缀合于氨基酸序列的核酸。所述生物正交铜催化的点击化学反应形成包含缀合于一个或多 个甘氨酸和任选地可切割的序列诸如酶可切割的序列(包括可被TEV蛋白酶(在本文中在一 些情况下也称为TEV)切割的氨基酸序列）的核酸的核酸中间产物。所述TEV可切割序列在本 文中可称为TEV祀序列。所述TEV祀序列可W是但不限于E-X1-X2-Y-X3-Q-(G/S)，其中Χ1、Χ2 和Χ3代表独立地选择的氨基酸。切割通常在Q与G或Q与S之间发生。TEV祀序列的实例包括 ENLYFQG(SEQIDN0:13WPENLYFQS(SEQIDN0:14)。
[0077] 可将中间产物与祀向可切割的序列的酶反应。在一个实例中，所述酶为TEV蛋白 酶。可将TEV蛋白酶缀合于纯化序列诸如但不限于化S-标签。
[0078]应理解，可进行本文中提供的方法而具有最少的试剂损失和从而最大的效率和广 率。还可获得不含反应组分包括不含底物、中间产物、酶和副产物的复合物。
[0079] 本文中提供的方法通过缀合方法维持或保持目标蛋白质的活性。在酶或具有可测 量的活性的其它蛋白质的情况下，所述蛋白质维持为其原始比活性或接近所述活性的比活 性。因此，核酸-蛋白质复合物或缀合物中的蛋白质的比活性为未缀合和未操作形式的蛋白 质的比活性的至少75 %、至少80%、至少85 %、至少90%、至少95 %、至少99%或约100 %。可 根据每mg蛋白质的活性单位定义比活性。在酶的情况下，所述活性单位可被称为酶单位，其 为在针对抑和溫度的特定反应条件下每单位时间被转化成产物的底物的量。
[0080] 本文中提供的方法克服了现有技术的各种挑战和/或缺点。例如，本文中提供的方 法不牵设亚最佳的蛋白质反应条件，包括在室溫、氧化/还原条件或非生理抑下的长时间溫 育。本文中提供的方法适合于非热稳定性蛋白质，所述蛋白质会另外地具有在现有技术条 件下聚集和/或从溶液沉淀出来的倾向。另外，通过同时除去亲和标记而直接标记成功的反 应，本文中提供的方法还促进从反应物纯化产物。运些方法还是通用的和强健的，并且可用 于实际上任何蛋白质，不同于倾向于针对个体蛋白质进行优化的现有技术方法。
[0081] 本公开内容还提供了分离形式的任何前述中间核酸-肤复合物或终核酸-蛋白质 复合物。分离形式意指复合物与其它(包括在一些情况下所有其它)反应组分(包括底物、中 间产物、副产物、酶等)是物理上分离的。
[0082] 本公开内容还提供了包含W下的两种或更多种的任意组合的多种组合物：
[0083] (1)缀合于包含末端甘氨酸(G)残基的氨基酸序列诸如但不限于GGG氨基酸序列、 GGG-TEV-Flag序列（其中在此上下文中的叮EV"是指TEV祀序列）或包含至少一个甘氨酸残 基(和优选地3个运样的残基）、可切割的序列诸如但不限于TEV祀序列和纯化标签诸如但不 限于标签诸如化S-标签或Flag序列的的任何其它序列的核酸；
[0084] (2)缀合于具有LPXTGX'n(SEQ ID N0:2)的末端氨基酸序列的蛋白质，其中X和X' 为任何独立选择的氨基酸并且η为大于0的数值或大于0的数值的范围；
[0085] (3)分选酶;和 [00化](4)TEV蛋白酶.
[0087] 本公开内容还提供了包含W下的两种或更多种的任意组合的多种组合物：
[0088] (1)缀合于包含末端甘氨酸(G)残基的氨基酸序列诸如但不限于GGG氨基酸序列、 GGG-TEV-Flag序列（其中在此上下文中的叮EV"是指TEV祀序列）或包含至少一个甘氨酸残 基(和优选地3个运样的残基）、可切割的序列诸如但不限于TEV祀序列和纯化序列诸如但不 限于标签诸如化S-标签或Flag序列的任何其它序列的核酸；
[0089] (2)缀合于具有LPETGXn(SEQ ID ^:3)的末端氨基酸序列的蛋白质，其中乂为氨基 酸并且η为大于0的数值或大于0的数值的范围；
[0090] (3)分选酶;和
[0091] (4)TEV 蛋白酶。
[0092] 在一些实施方案中，V'为大于1的数值。
[0093] 可将蛋白质、分选酶和TEV蛋白酶的任一种或任意组合缀合于纯化标签诸如但不 限于化S-标签或Flag-标签。可使用相同或不同的纯化序列。可将化S-标签包含在缀合于目 标蛋白质的X ' η氨基酸序列中。
[0094] 组合物可与特异性结合于纯化标签或序列的珠粒或其它亲和基质接触。例如，所 述珠粒可W是抗-His标签珠粒，因为它们在其表面上包含针对化S-标签的抗体或抗体片段 或其它结合伴侣。所述化S-标签是包含连续组氨酸残基的氨基酸序列，包括但不限于6个组 氨酸残基(SEQ ID NO:6)。
[OOM] 如上使用的V'可W是任何数值或任何数值范围，包括但不限于1至100或1至99， 或1至90。
[0096]本公开内容还提供了在组合物中的任何上述核酸-蛋白质复合物。运些组合物和 本文中提供的任何其它组合物还可包含载体，诸如但不限于药学上可接受的载体。术语"药 学上可接受的载体"意指适合用于对人或由本公开内容考虑的其它受试者施用的一种或多 种相容性固体或液体填充剂、稀释剂或封装物质。术语"载体"表示用其悬浮复合物W促进 施用的有机或无机成分(天然的或合成的）。将药物组合物的组分W阻止会显著减弱它们的 所需药物功效的相互作用的方式混合。所述载体可备选地为适合于体外工作但非药学上可 接受的载体。
[0097] 在一些实施方案中，本发明的组合物是无菌的，并且任选地可包含防腐剂。组合物 可W是包含一个或多个容器或器皿、任选地具有说明书的试剂盒。组合物可用于体内或体 外使用。
[0098] 本文中提供的复合物可用于许多应用，包括例如，测量分子相互作用的动力学和 在筛选测定中鉴定分子结合伴侣(从已知的或未知的候选者）。结合相互作用研究可使用许 多方法来进行，所述方法包括但不限于凝胶电泳、单分子力探针诸如光綴、磁綴、绳系粒子 运动、原子力显微镜(AFM)、离屯、力显微镜(CFM)和单分子巧光成像。应用进一步描述于公开 的PCT申请W02013/067489(其全部内容通过引用并入本文）中。
[0099] 本公开内容还提供了将核酸-蛋白质复合物用于一种或多种纳米技术应用诸如但 不限于核酸纳米结构中的方法。所述复合物还可用于研究结合相互作用和结合亲和力W及 蛋白质-蛋白质相互作用的强度。所述复合物还可用于将蛋白质错定于表面。
[0100] 如本文中所用，"核酸纳米结构"是从个体核酸自组装的合理设计的人工(例如，非 天然存在的）结构。运样的纳米结构可基于组成性核酸包括寡核巧酸的序列互补性来进行 自组装。"自组装"是指核酸及，在一些情况下，核酸纳米结构）W序列特异性方式、W预 测的方式并且在无外部控制的情况下彼此退火的能力。在一些实施方案中，核酸纳米结构 自组装法包括在单个容器中组合核酸(例如，单链核酸或寡核巧酸)和使所述核酸基于序列 互补性彼此退火。在一些实施方案中，该退火过程包括将核酸置于升高的溫度下，随后逐渐 降低溫度W有利于序列特异性结合。各种核酸纳米结构或自组装方法是已知的并且在本文 中进行了描述。
[0101] 核酸纳米结构通常是纳米级结构(例如，具有1至1000纳米的长度尺度），尽管在一 些情况下，术语"核酸纳米结构"和"DNA纳米结构"在本文中可指微米级结构(例如，从多于 一个纳米级或微米级结构组装的）。在一些实施方案中，核酸纳米结构具有1至lOOOnmU至 900nm、l至800nm、l至700nm、l至600nm、l至500nm、l至400nm、l至300nm、l至200nm、l至lOOnm 或1至50nm的长度尺度。在一些实施方案中，核酸纳米结构具有大于lOOOnm的长度尺度。在 一些实施方案中，核酸纳米结构具有1微米至2微米的长度尺度。
[0102] 在一些实施方案中，核酸纳米结构从多个不同的核酸（例如，单链核酸）组装。例 如，核酸纳米结构可从至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少 70个、至少80个、至少90个或至少100个核酸组装。在一些实施方案中，核酸纳米结构从至少 100个、至少200个、至少300个、至少400个、至少500个或更多个核酸组装。术语"核酸"包括 "寡核巧酸"。在DNA纳米结构的上下文中，在一些实施方案中，寡核巧酸具有10至20个核巧 酸、10至30个核巧酸、10至40个核巧酸、10至50个核巧酸、10至60个核巧酸、10至70个核巧 酸、10至80个核巧酸或10至90个核巧酸的长度。在一些实施方案中，寡核巧酸具有20至50、 20至75或20至100个核巧酸的长度。在