r>[0065] a.在约0和约50°C之间的溫度下，将破碎的植物材料浸泡在水中；在一个实施方式 中，在约4°C和约20°C之间的溫度下；
[0066] b.使步骤(a.)的产物经受固液分离W获得含水提取物；
[0067] C.适合地在多级过滤过程中过滤步骤(b.)的含水提取物，但是至少穿过具有约 0. Ιμπι的最大平均孔径的微滤材料；
[0068] d.使来自步骤C.的滤出液经受超滤W除去分子量低于约300kDa(在一个实施方式 中，低于约400kDa;在一个实施方式中，低于约500kDa)的杂质，W获得包含单分散性植物糖 原纳米颗粒的组合物。
[0069] 在一个实施方式中，方法进一步包括离屯、步骤b的产物。
[0070] 然后可W干燥含水组合物W得到基本上为单分散性植物糖原纳米颗粒的组合物。 [0071 ]在一个实施方式中，植物材料是谷物。在一个实施方式中，植物材料是玉米、水稻、 大麦、高梁或它们的混合物。在一个实施方式中，植物材料是甜玉米(玉米变种saccharata 和玉米变种rugosa)的巧粒。在一个实施方式中，使用甜玉米的乳熟期或凹陷期的成熟巧 粒。
[0072] 在各个实施方式中，植物糖原的收率为植物材料干重的约5%和50%之间、约10% 和约50%之间、约20%和50%之间、约30%和约50%之间、约40%和约50%之间、约10%和 约40 %之间、约20 %和40 %之间、约30 %和约40 %之间。植物糖原的准确产率将取决于所使 用的植物材料，包括品种和成熟期。W玉米为例，对于乳熟期巧粒成熟期，发明人们已经获 得在巧粒干重的35-40%的范围内的收率，而对于凹陷成熟期获得了20-30%的收率。考虑 到先前报道的植物糖原的高多分散性，单分散性植物糖原的运些收率是出乎预料的。
[0073] 制备破碎植物材料的方法对于本领域技术人员是众所周知的。生物质破碎的方法 包括研磨、娠磨或粉碎生物材料。植物材料被适合地破碎成小于约0.5mm的平均颗粒尺寸。
[0074] 在一个实施方式中，通过适度揽拌10-30分钟进行冷水提取。在一个实施方式中， 冷水提取是在约〇°C和约50°C之间的溫度下进行的。在一个实施方式中，在约4°C和约20°C 之间的溫度下进行冷水提取。揽拌的最佳周期、溫度和揽拌速率取决于破碎的生物质的性 质，并且对它们的确定处于本领域技术人员的技能范围内。
[0075] 将由冷水提取产生的含水提取物离屯、W分离出粗制非可溶性固体。适合地，可选 地在约3,000至约6,OOOx g下离屯、提取物。适合地，通过在约6,000至约12,OOOx g下进行进 一步离屯、，运从粗制植物糖原提取物中部分地分离出精细分散的蛋白质和脂质。
[0076] 离屯、之后是过滤上清液。如本文所描述的，进行多级过滤和超滤，已经惊人地发现 运除去了大部分的蛋白质、脂质和污染性多糖(包括直链淀粉和支链淀粉），而不需要任何 的化学处理、酶处理或热处理，由此产生单分散性植物糖原纳米颗粒的组合物。适合地在使 用Ο.?μπι最终介质孔径的阶段中进行微滤。在一个实施方式中，微滤依次使用如下介质孔径 进行:a)在一个实施方式中，约5μπι和约50μπι之间，在一个实施方式中，约ΙΟμπι和约40μπι之 间，在一个实施方式中，约15μπ?和约35μπ?之间，在一个实施方式中，约20μπ?和约30μπ?之间，并 且在一个实施方式中，约25ym;b)在一个实施方式中，约0.5WI1和约2. Ομπι之间，在一个实施 方式中，约1.Ομπι;和C)在一个实施方式中，约0.05μπι和约0.15μπι之间，在一个实施方式中， 0. Ιμπι。在一个实施方式中，在离屯、之前，可W向植物抗原提取物中加入吸附性过滤助剂诸 如娃藻±。在一个实施方式中，W约2-10%wt/体积的量使用吸附性过滤助剂，在一个实施 方式中，约3-5 % wt/体积之间。
[0077] 使来自微滤的最终滤出液经受超滤，其从中去除低分子量污染物包括盐、蛋白质 和糖(例如糊精、葡萄糖、薦糖或麦芽糖）。超滤可W使用具有约300至约500W)a的分子量截 止(MWC0)的交叉流过滤(CF巧来进行。
[0078] 微滤和超滤的各种方法均为本领域技术人员众所周知并且可W采用任何适合的 方法。
[0079] 可选地，在超滤之后，可W使含有植物糖原的含水分散体经受酶处理W降低多分 散性。适合地，其可W使用淀粉薦糖酶、糖原合成酶、糖基转移酶和支化酶或它们的任何组 合进行处理。但是，应当避免消化支链淀粉和直链淀粉(例如，β-淀粉酶）的酶，因为它们会 产生各种降解的聚葡糖的溶液，而非植物糖原纳米颗粒的纯化组合物。
[0080] 可W通过CFF超滤工艺浓缩植物糖原分散体(最高达30% )。可替代地，在CFF超滤 之后，可W使用适合的有机溶剂诸如丙酬、甲醇、丙醇等(优选乙醇)沉淀植物糖原。方法进 一步包括适合地通过喷雾干燥或冷冻干燥来干燥植物糖原提取物。各种标准浓缩和/或干 燥方法诸如使用降膜蒸发器、升膜蒸发器、喷雾干燥、冷冻干燥、滚筒干燥或它们的组合等 来脱水植物糖原分散体和/或收集固体形式的植物糖原产物。
[0081] 如实施例中示出的，取决于所使用的起始植物材料，所得到的植物糖原的材料的 特征在于30nm和150nm之间的颗粒直径，连同通过化S现慢的低至0.07的多分散指数。
[0082] 确保高纯度材料及其单分散性的关键在于精细微滤和超滤的组合。
[0083] 纳米颗粒的化学官能化
[0084] 本发明的实施方式包括具有化学官能化表面的纳米颗粒和分子和/或与各种各样 的分子结合的纳米颗粒。化学官能化在合成领域中是众所周知的。参见例如March, Advanced (Organic Chemistry,第六版,Wiley,2007。官能化可W在颗粒的表面进行或同时 在颗粒的表面和内部进行，但是将糖原分子的结构维持为如上的单支化均聚物。
[0085] 此类官能化的表面基团包括但不限于亲核基团与亲电基团、酸性基团和碱性基 团，包括例如幾基、胺基、硫醇基、簇基或其他酸性基团。氨基可W是伯、仲、叔或季氨基。可 W使用不饱和基团诸如乙締基和締丙基官能化本文所描述的纳米颗粒。
[0086] 所分离和纯化的纳米颗粒可W被直接或间接官能化，在间接官能化中可W使用一 个或多个中间接头或间隔子。纳米颗粒可W经受一个或多于一个官能化步骤，包括两个或 更多个、Ξ个或更多个或四个或更多个官能化步骤。
[0087] 官能化的纳米颗粒可W进一步与各种的分子结合，分子在各种应用中是感兴趣 的，诸如生物分子、小分子、治疗剂、微粒和纳米颗粒、药物活性部分、大分子、诊断标签、馨 合剂、分散剂、电荷改性剂、粘度改性剂、表面活性剂、凝聚剂和絮凝剂，W及运些化合物的 各种组合。
[0088] 可W使用用于多糖官能化或衍生化的已知方法。例如，一种方法是通过选择性氧 化C-2、C-3、C-4和/或C-6位的葡萄糖径基来导入幾基。存在有广泛的可使用的氧化剂，诸如 高舰酸盐(例如高舰酸钟）、漠、二甲基亚讽/乙酸酢(DMS0/AC20)[例如，美国专利号4,683， 298]、戴斯-马下高舰烧(Dess-Ma;rtin periodinane)等。
[0089] 本文所描述的纳米颗粒在用幾基官能化时可容易地与携带有伯胺基或仲胺基的 化合物反应。运导致形成亚胺，其可W使用还原剂例如棚氨化钢被进一步还原为胺。因此， 还原步骤提供比亚胺中间体更稳定的氨基产物，并且还将未反应的幾基转化为径基。幾基 的消除显著地降低了衍生的纳米颗粒与非祀分子(例如血浆蛋白）的非特异性相互作用的 可能性。
[0090] 可W在一个容器中同时进行幾基化合物和氨基化合物之间的反应W及还原步骤 (向相同反应混合物中导入适合的还原剂）。运种反应被称为直接还原胺化反应。此处，可W 使用在幾基的存在下选择性还原亚胺的任何还原剂，例如氯基棚氨化钢。
[0091] 为了从幾基官能化的纳米颗粒制备氨基官能化的纳米颗粒，可W使用任何锭盐或 含伯胺或仲胺的化合物，例如乙酸锭、氯化锭、阱、乙二胺或己二胺。运种反应可W在水中或 在含水极性有机溶剂例如乙醇、DMS0或二甲基甲酯胺中进行。
[0092] 还可W通过使用下列两步法来实现本文所描述的纳米颗粒的还原胺化。该第一步 是締丙基化，即通过在还原剂例如棚氨化钢的存在下与締丙基面反应将径基转化为締丙 基。在第二步骤中，使締丙基与双官能氨基硫醇化合物例如氨基乙硫醇反应。
[0093] 可W进一步修饰氨基官能化的纳米颗粒。例如，氨基与幾基化合物(醒和酬）、簇酸 及其衍生物(例如酷氯、醋）、班巧酷亚胺醋、异硫氯酸醋、横酷氯化物等反应。
[0094] 在某些实施方式中，使用氯基化过程将本文的纳米颗粒官能化。运种过程导致在 多糖径基上形成氯酸醋和亚氨基碳酸醋。运些基团在非常溫和的条件下可W与伯胺容易地 反应，形成共价键。氯化剂诸如漠化氯并且优选1-氯基-4-二乙基氨基-化晚盐(CDAP)可W 被用于纳米颗粒的官能化。
[0095] 官能化的纳米颗粒可W被直接附接至携带有能够结合幾基或氨基的官能团的化 合物。但是，对于一些应用，通过间隔子或接头(包括例如聚合物间隔子或接头)来附接化合 物可能是重要的。运些可W是携带有官能团（包括但不限于氨基、幾基、琉基、班巧酷亚胺 基、马来酷亚胺基和异氯酸醋）的同双官能接头或异双官能接头，例如二氨基己烧、糖双(横 基班巧酷亚胺基班巧酸）乙二醋(横基-EGS)、二横基班巧酷亚氨基酒石酸醋(横基-DST)、二 硫代双(横基班巧酷亚胺基丙酸醋KDTSSP)、氨基乙硫醇等。
[0096] 用于纳米颗粒/结合的化合物和改性剂
[0097] 在某些实施方式中，可W被用来修饰