酸由苏氨酸突变成丙氨酸、54位氨基酸由脯氨酸突变成丝氨酸、68 位氨基酸由丝氨酸突变成苏氨酸、79位氨基酸由苏氨酸突变成天冬氨酸、85位氨基酸由酪 氨酸突变成半胱氨酸、100位氨基酸由异亮氨酸突变成甲硫氨酸、103位氨基酸由颉氨酸突 变成谷氨酸、104位氨基酸由甘氨酸突变成精氨酸、106位氨基酸由苏氨酸突变成甘氨酸、 112位氨基酸由赖氨酸突变成天冬酰胺、113位氨基酸由谷氨酸突变成丙氨酸、120位氨基酸 由精氨酸突变成赖氨酸、124位氨基酸由谷氨酰胺突变成精氨酸、131位氨基酸由赖氨酸突 变成苏氨酸、151位氨基酸由苯丙氨酸突变成亮氨酸、160和163位氨基酸由丝氨酸突变成精 氨酸。
[0031] 综合运用生物信息学工具对突变的肝靶向干扰素的结构和稳定性进行分析:利用 BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)nBLAST 2 ( BLOSUM 62 matrix) ( www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/wblast2.cgi)、clustal X 1. 8 和SWISS-MODEL (http: //swissmodel. expasy. org/SWISS-MODEL)进行高级结构预测，将突变的肝革E向干扰 素的氨基酸序列与三维结构数据库FOB (http: //www. rcsb. org/pdb)中的蛋白序列进行 比对，选择相似性最高的序列作为模型进行同源建模，分析比对原始肝靶向干扰素与突变 肝革G向干扰素的结构，以Swiss-Pdb Viewer软件查看pdb文件结果，结果显示相比原始肝 靶向干扰素，突变的肝靶向干扰素在三个结构位点引起改变（见图2)。利用AMBER 9.0 software package进行分子动力学分析，结果显示相比原始肝祀向干扰素，突变的肝革巴向 干扰素的结构波动更小，即突变肝靶向干扰素比原始肝靶向干扰素更稳定(见图3)。
[0032] 实施例2 为适应原核表达需要，提高效率，我们利用在线稀有密码子分析软件Rare Codon Calculator (RaCC)(网址：http://nihserver.mbi .ucla.edu/RACC/)对突变的肝革巴向干 扰素对应的核苷酸序列中的大肠杆菌表达稀有密码子进行分析，RaCC提供精氨酸(AGG、 06八^64)、亮氨酸(0^)、异亮氨酸(414)和脯氨酸(00：)4种氨基酸的分析结果（图4)。在此 基础上，选用大肠杆菌中高表达基因常用密码（http://www.kazusa.or. jp/codon/)，根据 突变肝靶向干扰素的氨基酸序列设计其基因的碱基序列（图5)，具体优化策略为将原始核 苷酸序列中的大肠杆菌稀有密码子精氨酸以66、064^64)、亮氨酸(〇^)、异亮氨酸(4了4)和 脯氨酸(CCC)分别替换为大肠杆菌高效表达基因常用密码子精氨酸(CGT)、亮氨酸(CTT)、异 亮氨酸(ATT)和脯氨酸(CCA)。
[0033] 实施例3 突变肝靶向干扰素融合基因的构建:实施例2所述的突变肝靶向干扰素的核酸序列(基 因全长为555 bp)为基础，分别在5'端和3'端加入限制性内切酶Nde I和Xho I位 点，并在两端加上酶切位点保护碱基，这样序列全长为588 bp。将整个基因分成16个相互重 叠的寡核苷酸片断，用Primer Premier 5.0生物软件设计引物，引物序列如SEQ ID N0:5 ~20所示。设计时SEQ ID NO:5和SEQ ID NO: 20两个片断相对较小，可作为全长片断的两 端引物，其余寡核苷酸片断在58 bp左右。 采用S0E-PCR技术三步扩增重组融合基因，基本流程如图6所示： 1、PCR扩增片段IC 1-2、IC 3-4、I C 5-6、IC 7-8、IC 9-10、IC 11-12、IC 13-14、IC 15-16,引物IC 1、IC 2用于PCR合成扩增IC 1-2特异片段(68 bp)，其余类似。PCR反应体系 见表1:
PCR扩增条件为:98°C 10 sec，68°C 30 sec，循环10次。4%琼脂糖凝胶电泳检测特异 扩增片段的大小。
[0034] 2、S0E-PCR扩增片段IC 1-4、IC 5-8、IC 9-12、IC 13-16:以上述步骤 1 中的PCR产 物为模板，由于 1C 1-2和IC 3-4、IC 5-6和IC 7-8、IC 9-10和IC 11-12、IC 13-14和IC 15-16相邻片段之间均具有部分重叠链，在扩增反应中通过重叠链的延伸从而将两段基因拼接 起来，合成IC 1-4、IC 5-8、IC 9-12、IC 13-16。再以引物P1、P4等为上下游引物进行大量扩 增，其余类似。PCR反应体系见表2:
扩增条件为:98°C 10 sec，68°C 30 sec，循环10次，取出Eppendorf管加入1 μL的引 物IC1 (10 μΜ)和1 μL的引物IC4 (10 1 μΜ)，Eppendorf管置入DNA扩增仪中，反应条件 为:98°C 10 sec，68°C 30 sec，循环30次。2%琼脂糖凝胶电泳检测特异扩增片段的大小， 采用北京TIANGEN公司的TIANgel Midi Purification Kit纯化PCR产物，具体见试剂盒说 明书。
[0035] 3、S0E-PCR重组全长融合基因：以步骤2获得的PCR回收产物为模板，由于1C 1-4和 IC 5-8、IC 9-12和1C 13-16相邻片段之间均具有部分重叠链，在扩增反应中通过重叠链的 延伸从而将四段基因拼接起来，合成全长的融合蛋白基因。然后再以引物IC1和IC16为上下 游引物进行大量扩增。最后用TaKaRa Taq聚合酶为融合基因加上Poly A尾，以利于下一步 的TA克隆。PCR反应体系见下表。
[0036] 反应条件为:98°C 10 sec，68°C 40 sec，循环 10 次。取出Eppendorf管加入 1 μL 的引物IC1 (10 μΜ)和1 μL引物IC16 (10 1 μΜ)，Eppendorf管置入DNA扩增仪中，反应条 件为：98°C 10 sec，68°C 40 sec，循环30 次。取出Eppendorf管加入0·25μ1 的TaKaRa Taq 酶（5 units/μL)，Eppendorf管置入DNA扩增仪中，72°C延伸2〇11^11。1.5%琼脂糖凝胶电泳检 测特异扩增片段的大小，电泳结果显示扩增获得约600 bp的片段(图7)。
[0037] 4、将步骤3大量扩增的PCR产物，采用TIANgel Midi Purification Kit回收纯 化，具体步骤按照试剂盒说明书。然后将回收产物与PMD19-T载体相连接，连接产物转化感 受态细胞E.coil DH 5α，获得阳性重组子，阳性重组子的鉴定采用菌落PCR鉴定（图8)、重组 质粒的酶切鉴定（图8)和测序鉴定，从阳性重组子中提取获得重组质粒Mu IFN-CSP/pMD19-T〇
[0038]实施例4突变肝靶向干扰素重组表达质粒的构建 将原核表达载体pET21b和实施例3构建成功的重组质粒Mu IFN-CSP/pMD19-T分别进行 双酶切并连接（重组质粒构建流程如图9)。按照TIANGEN公司的TIANpure Midi Plasmid Kit说明书分别提取重组质粒Mu IFN-CSP/pMD19-T和原核表达质粒pET21b，将抽提得到的 质粒分别用限制性内切酶Xho I和Nde I进行双酶切，分别回收酶切产物后，将酶切的目的 基因与酶切pET21b质粒参照摩尔比3:1通过T4连接酶进行连接反应，连接产物转化大肠杆 菌DH5a，转化菌种涂于含有氨苄青霉素的平板，培养16