CCC GCT GAG GGA GTT G-3'，如SEQ ID N〇:5所示，其中划单线序列为G-四倍体的互补序列，划双线序列为切 刻内切酶的识别位点。
[0037] 优选的，所述荧光分子为NMM(N_甲基卟啉二丙酸IX)。
[0038]优选的，所述SDA反应中采用的DNA聚合酶为具有链置换活性的DNA聚合酶，如 Klenow Fragment聚合酶。
[0039]优选的，滚环扩增反应中采用的DNA聚合酶为phi 29DNA聚合酶。
[0040] 本发明还提供一种检测蛋白质和生物小分子物质的试剂盒，包括：
[0041] (1)权利要求1~3中任一项所述的自锁式适体探针；
[0042] (2) DNA聚合酶、切刻内切酶、T4DNA连接酶；
[0043] (3)dNTPs、、荧光分子和KC1溶液；
[0044] (4)Cutsmart缓冲液、T4DNA连接酶的缓冲液；
[0045] (5)上述模板1和模板2。
[0046] 优选的，所述DNA聚合酶包括Klenow Fragment聚合酶和phi 29DNA聚合酶。
[0047]本发明的有益效果是：
[0048]本发明构建了一个自锁式适体探针。该探针具有三重功能：一是基于其3'端适体 序列的分子识别功能;二是基于其5'端信号序列的信号转导功能;三是基于信号序列与适 体序列杂交的自锁功能。由于信号序列与适体序列的杂交是分子内杂交，所以这种自锁式 适体探针要比阻滞链阻滞的适体探针稳定，因此更加有利于减少适体非特异性折叠和干扰 信号。此外，为了保证方法的灵敏度，本发明还设计了以该自锁式适体探针为基础的级联扩 增策略，实现了血小板源生长因子BB(PDGF-BB)的高灵敏和高特异性检测，检测限达3.8 X l(T16m〇l/L，线性范围超过6个数量级。通过改变适体序列，该策略也被成功用于小分子-腺 苷的灵敏检测，说明该自锁式适体探针具有很好的通用性，在生物分子的实际检测方面具 有很大的应用潜力。
[0049]本发明采用自锁式适体探针与SDA反应和DE-RCA反应相结合的策略，实现生物蛋 白分子和生物小分子物质的高灵敏度和高特异性检测。
【附图说明】
[0050]图1:自锁式适体探针介导的级联扩增策略用于蛋白质的灵敏、特异检测的原理 图。
[0051 ] 图2(A):不同浓度PDGF-BB的荧光图谱图；其中，a-l依次为blank、2X10-15M、5X 10-15M、1 X 10-14M、1 X 10-13M、1 X 10-12M、1 X 10-nM、1 X 10-10M、1 X 10-9M、1 X 10-8M、2 ·0 X 10- 8M、5X10-8M〇
[0052] 图2(B):荧光强度与PDGF-BB浓度的线性关系图。
[0053] 图3:方法的特异性考察示意图。
[0054]图4(A):腺苷检测原理图。
[0055] 图4(B):不同浓度腺苷的荧光响应图；其中，a-i依次为blank、l X 10_7M、5 X 10- 7M、1 X 10-6M、5 X 10-6M、1 X 10-5M、5 X 10-5M、8 X 10-5M、1 X 10-4M〇
[0056] 图4(C):不同浓度腺苷及荧光强度的线性关系图。
【具体实施方式】 [0057] 实施例1
[0058] 1.实验部分
[0059] 1.1试剂和材料
[0060] 实验中所用DNA(序列如表1)和dNTPs由生工生物工程有限公司（中国，上海)合成 和纯化;血小板源生长因子(PDGF-BB)、人免疫球蛋白G(Ig G)、人肿瘤坏死因子a(TNF-a)、 人干扰素 y (IFN-γ )和凝血酶购自ProSpec-Tany公司（耐斯茨奥纳，以色列）；腺苷购自 Sigma-Aldrich公司（圣路易斯，美国）；Klenow Fragment聚合酶、切刻酶Et .BbvCI、T4DNA连 接酶和phi 29 DNA聚合酶购自New England Biolabs公司（美国）；NMM购自J&K Scientific 公司（北京，中国）；其它试剂(分析纯)购自标准供应商。
[0061 ] 实验过程中所用HEPES缓冲液包含50mM NaCl和25mM HEPES(pH 7.0);PBS缓冲液 包含0.15M NaCl、2.4mM NaH2P〇4和7.6mM Na2HP〇4(PH 7.4);TE缓冲液包含lOmM Tris和 l.OmM Na2EDTA(PH 8.0) 〇
[0062] 表1实验中所用DNA序列
[0063]
[0064] 注:双划线序列为PDGF-BB适体序列分别，点划线序列腺苷的适体序列；单划线序 切刻酶Et.BbvCI识别位点，波浪线序列为G-四倍体的互补序列。
[0065] 1.2绑定诱导的链取代扩增(SDA)
[0066] 将TO⑶-BB (10nM，5yL)和自锁式适体探针（50nM，5yL)在37 °C下孵育lh。随后加入 0.4yL KF聚合酶、0.2yL Nt.BbvCI、4yL 2mM dNTPs、2yL Cutsmart和3.4yL水，37°C下孵育 2.5h。最后通过80°C加热lOmin使SDA反应终止。
[0067] 1.3连接反应
[0068] 向上述20yL SDA产物中加入1.4yL 10μΜ模板l、0.3yL T4 DNA连接酶、3.0yL T4 DNA连接酶缓冲液和5.3yL水，37 °C下反应40min。
[0069] 1.4双重指数型滚环扩增(DE-RCA)
[0070] 取上述30yL连接反应产物，加入1.4yL 10μΜ模板2、0.4yL phi 29聚合酶、0.4μ LNt · BbvCI、5yL Cutsmart、10yL dNTPs和22 · 8yL水，37°C下反应5h。该步反应通过80°C加热 lOmin终止。
[0071] 1.5荧光检测
[0072] 取上述DE-RCA产物，加入5yL 2mM KC1 和5yL 0.08mM NMM，37°C 下反应40min。最后 用Hitachi F-7000荧光仪进行荧光测定，激发波长选择399nm，发射波长的收集范围选择 550~680nm，最终选择612nm处的荧光强度考察方法的灵敏度。
[0073] 2.结果与讨论
[0074] 2.1原理
[0075] 如图1，首先设计并构建了一个自锁式适体探针。该探针包括两部分:3'端的适体 序列和5'端的信号转导序列。此外，该信号转导序列能够与适体序列部分杂交，使探针在无 目标物时处于自锁状态，从而不发生折叠，保证方法的低背景。本方法中，选择癌症相关的 PDGF-BB作为模型分析物。当体系中有PDGF-BB存在时，适体探针与PDGF-BB结合，折叠成三 向螺旋结构，打开5 '端的发夹结构。接下来，在KF聚合酶、切刻酶Et. BbvCI和dNTP存在时，3 ' 端的三向螺旋结构作为引物触发SDA反应，产生大量的引物1。接着，引物1与模板1杂家，在 phi 29聚合酶的作用下触发线性RCA反应，产生一条长的单链DNA产物。该产物能够与体系 中过量的模板1杂交，暴露出切刻酶的识别位点，从而被切刻酶切刻，产生大量的引物2。而 游离的引物1/模板1复合物有可进行下一个聚合、切刻循环，完成第一级指数型RCA扩增。最 后，引物2与模板2杂交，触发第二级指数扩增反应，产生大量的G-四倍体序列，插入NMM后， 产生增强的荧光信号。
[0076] 2.2条件优化
[0077] 分别对SDA反应时间、DE-RCA反应时间、phi 29聚合酶用量、Et.BbvCI用量和NMM浓 度进行了优化。最终选择SDA时间为2.5h、DE-RCA反应时间为5h、phi 29聚合酶用量为4U、 Et.BbvCI用量为4U、NMM终浓度为5μΜ。
[0078] 2.3灵敏度考察
[0079] 在最优条件下，对方法的灵敏度进行了考察，如图2，在2.0 X l(T15m〇l/L~1.0 X l(T8mol/L范围内，荧光强度与目标物浓度的线性关系良好，线性方程为AF = 2548.4+ 713.01gC，检测限为 3.8X10-16mol/L。
[0080] 2.4特异性考察
[00811以Ig G、TNF-a、IFN_y和凝血酶为干扰目标物，对方法的特异性进行了考察。如图 3，本方法仅对TOGF-BB具有强的荧光响应，对其它蛋白的荧光响应很小，说明本方法具有很 好的特异性。
[0082] 2.5通用性考察
[0083] 为了考察方法的通用性，将探针的适体部分更换成腺苷的适体序列，实现了对腺 苷的灵敏检测。如图4，方法在1.0 X 1 (T7mo 1 /L~1.0 X 1 〇Λιο 1 /L范围内，焚光强度与腺苷浓 度的线性关系良好，检测限为4.8X10_8mol/L。
[0084] 另外，将探针的适体序列更换为其它生物分子的适体序列，也能对其进行高灵敏 度和高特异性地检测。
[0085] 3.总结
[0086] 这项工作中，本发明构建了 一个自锁式适体探针，结合SDA和DE-RCA的级联扩增， 实现了蛋白质和小分子的高灵敏、高特异性检狈彳，检测限分别达3.8Xl(T16m〇l/L和4.8X 10-8mol/L〇
[0087] 参考文献：
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