色谱柱，3倍柱体积正己烷平衡，含有小分子提取物的样品溶液上样，3倍柱体积正己烷淋洗，5倍柱体积50%正己烷-乙酸乙酯溶液洗脱，获得前处理样品O
[0065](5)将获得的前处理样品在以填料为正相分离材料Silica(粒径8 μπι)的制备色谱上进行分离纯化，采用的分离色谱柱直径为150mm、柱长为250mm，采用A为正己烧、B为乙酸乙酯二元流动相体系进行分离纯化；分离纯化的条件为:0?15min 100% A、0% B，15?35min 60% A、40% B，35?50min 0%AU00% B，按照梯度洗脱样品，检测波长为260nm，进样量为1.2g，流速750mL/min，按照色谱峰进行收集，色谱峰如图1 (c)所示，收集25_29min洗脱液(Fr6峰)作为目的组分，减压浓缩至膏状，得到一维液相组分。
[0066](6)将一维液相组分在以填料为正相分离材料Silica的制备色谱上进行分离纯化，采用的正向分离材料Silica的粒径为10 μm，采用的分离色谱柱直径为50mm、柱长为250mm，采用A为正己烷、B为乙酸乙酯二元流动相体系进行分离纯化；分离纯化的条件为:O ?50min，88% A ?88% A ;50 ?55min，88% A ?0% A ;55 ?60min，0% A ?0% A，按照梯度洗脱样品，检测波长:260nm，上样量:348mg，流速50mL/min。按照色谱峰进行收集，色谱峰如图2(c)所示，收集27.5-36min洗脱液(Fr6_4峰)作为目的组分，旋转蒸发浓缩至干，即为本发明目的组分，经HPLC分析，其纯度达到97.3%。
[0067]对上述得到的目的组分进行NMR碳谱氢谱分析，显示其为麦角留醇，其结构式如图8所示。
[0068]实施例4:抗肝癌活性实验
[0069](I)在5% C02，37°C，饱和湿度下，用F-12K(10% FBS+1 % PS)培养基培养人肝癌HepG2细胞，选取对数期生长的细胞作为实验细胞。细胞计数后用培养基稀释为一定浓度的细胞悬液。
[0070](2)将细胞实时监测仪放入5% CO2, 37°C饱和湿度培养箱中。取8孔板，每孔加入150 μ L F-12K培养基，放入细胞实时监测仪中走基线，走完基线后取出八孔板，每孔加入稀释好的IfepG2细胞悬液345 μ L，至每孔细胞数约2万，静置3min，在倒置显微镜下观察细胞是否均匀。每孔加入5 μ L稀释好的样品，样品设置三个浓度，终浓度分别为20 μ g/ml、50 μ g/ml,80 μ g/ml o用含0.1 % DMSO的培养基作为空白对照组，放入细胞实时监测仪中检测，得到黄绿蜜环菌子实体抗肝癌活性实时增殖图，实验结果如图5、图6所示。实验结果说明黄绿蜜环菌子实体组分Fr6-4，即麦角留醇对肝癌细胞的增殖具有较好的抑制作用，且对肝癌HepG2细胞增值的抑制效果与麦角留醇的浓度呈正相关。图7为细胞给予在50 μ g/ml、80 μ g/ml Fr6_4后的状态图，在麦角留醇的浓度为80 μ g/ml时，肝癌!fepG2细胞基本停止生长。因此，麦角留醇具有开发成抗肝癌药物的潜力。
[0071]本发明采用RTCA实时无标记细胞分析技术进行抗肝癌活性实验的监测。RTCA实时无标记细胞分析技术是一种基于新型的细胞分析仪而建立的具有实时监测、高信息量、无需标记、全自动化、高灵敏度和高准确性等独特优点的检测技术。该细胞分析仪通过嵌在E-plate板上孔底的微电子感应器阻抗变化去感受细胞的有无以及贴壁、黏附和生长程度的改变。在细胞毒性检测中，可实时、直观的反应细胞增殖、存活、凋亡、形态变化等细胞生物学变化。该技术使得细胞实验变得更加省时高效。
[0072]本发明实施例涉及到的材料、试剂和实验设备，如无特别说明，均为符合中药提取的市售产品。
[0073]以上所述，仅为本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的核心技术的前提下，还可以做出改进和润饰，这些改进和润饰也应属于本发明的专利保护范围。与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。
【主权项】
1.一种从黄绿蜜环菌中提取麦角留醇的方法，其特征在于包括以下步骤: (1)以黄绿蜜环菌子实体为原料，室温阴干处理后，在40?60°C温度下烘干脱水，然后进行超微粉碎处理，获得超微粉； (2)将超微粉按Ig: (6?15)mL的料液比加入分析纯水，混合均匀后在60?90°C温度下提取I?2h，提取结束后在4000?8000rpm转速下离心，取沉淀重复I?3次，最后得到沉淀放入烘箱50?80°C干燥处理； (3)在步骤(2)所得的干燥沉淀中按质量体积比加入I?5倍的丙酮冷浸提取3?8h，提取结束后在4000?8000rpm转速下离心，取沉淀重复I?3次，收集所有上清液减压浓缩至膏状，获得小分子提取物； (4)在小分子提取物中按质量体积百分比加入5?10倍的正己烷-乙酸乙酯二元混合溶剂，进行超声溶解，溶解后过有机滤膜，得到含有小分子提取物的一维上样溶液； (5)对一维上样溶液进行高效液相色谱分离:采用的色谱柱为Silica正相硅胶色谱柱，采用的流动相为二元混合有机相，其中A相为正己烷，B相为乙酸乙酯，进样量为800-1200mL/针，流动相流速为600_750mL/min，检测器为紫外检测器，检测波长260nm，采用的洗脱方式为A相浓度100%等度洗脱O?15min、A相浓度60%等度洗脱15?35min、B相浓度100%等度洗脱35?60min，根据紫外吸收光谱收集25_29min洗脱液作为目的组分，减压浓缩至膏状，得到一维液相组分； (6)在得到的一维液相组分中按质量体积百分比加入5?10倍的正己烷-乙酸乙酯二元混合溶剂，进行超声溶解，溶解后过有机滤膜，得到二维上样溶液； (7)进行二维高效液相色谱分离:采用的色谱柱为Silica正相硅胶色谱柱，采用的流动相为二元混合有机相，其中A相为正己烷，B相为乙酸乙酯，进样量为20-80mL/针，流动相流速为40-80mL/min，检测器为紫外检测器，检测波长260nm ;采用的洗脱方式为A相浓度88%等度洗脱0-45min，根据紫外吸收光谱收集27.5_36min洗脱液作为目的组分，旋转蒸发浓缩至干，即为本发明目的化合物麦角甾醇。2.根据权利要求1所述的从黄绿蜜环菌中提取麦角留醇的方法，其特征在于:所述步骤(4)、(6)中正己烷-乙酸乙酯二元混合溶剂中正己烷的体积分数为50?90%。3.根据权利要求1所述的从黄绿蜜环菌中提取麦角留醇的方法，其特征在于:所述步骤(5)中的Silica正相硅胶色谱柱的尺寸为直径50-150mm、柱长250mm，其中硅球粒径为8 μ m，使用时柱温为室温或25-40 °C。4.根据权利要求1所述的从黄绿蜜环菌中提取麦角留醇的方法，其特征在于:所述步骤(7)中的Silica正相娃胶色谱柱的尺寸为直径50mm、柱长250mm，其中娃球粒径为10 μ m，使用时柱温为室温或25-40 °C。5.权利要求1所述的从黄绿蜜环菌中提取得到的麦角留醇在制备抗肝癌药物中的应用。
【专利摘要】本发明提供一种从黄绿蜜环菌中提取麦角甾醇的方法：将黄绿蜜环菌子超微粉碎后加入丙酮冷浸提取，过滤取上清减压浓缩；溶解后在Silica正相硅胶色谱柱分离，采用A相正己烷、B相乙酸乙酯二元流动相，按A相100％0～15min、A相60％15～35min、B相100％35～60min洗脱，收集25-29min洗脱液减压浓缩；溶解后再在Silica正相硅胶色谱柱分离，采用A相正己烷、B相乙酸乙酯二元流动相，按A相88％0-45min洗脱，收集27.5-36min洗脱液旋转蒸发，得到纯度达95％以上的麦角甾醇。该分离方法稳定，重复性高，制备量大，得到的麦角甾醇可用于制备抗肝癌药物中。
【IPC分类】A61P35/00, A61K31/575, C07J9/00
【公开号】CN105693804
【申请号】CN201410708015
【发明人】张耀洲, 马琳, 唐楚沉, 顾朋嫒, 李聪聪
【申请人】天津耀宇生物技术有限公司
【公开日】2016年6月22日
【申请日】2014年11月28日