Academic Press,1993,pp. 15-38 ;Jenes B等.Techniques for Gene Transfer,Transgenic Plants,第 I卷,Engineering and Utilization,Academic Press, 1993, pp. 128-143,等）。±壤杆菌菌株（例如根瘤±壤杆菌或毛根±壤杆菌）包含 质粒（Ti或化质粒）和T-DNA元件，所述质粒和元件在用±壤杆菌转染后被转移至植物， 而T-DNA被整合进植物细胞的基因组中。T-DNA可位于化-质粒或Ti-质粒上，或独立地包 含在所谓的双元载体中。±壤杆菌介导的转化方法描述于例如中。±壤杆菌介导的转化最 适合双子叶植物，但是也适合单子叶植物。±壤杆菌对植物的转化描述于例如中。转化可 导致瞬时或稳定的转化和表达。尽管本发明的核巧酸序列可被插入落入送些广泛种类中的 任何植物和植物细胞中，但是其尤其适用于作物植物细胞。
[0031] 与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果；本发明提供了一种水稻花粉发育 基因 W及基于该基因突变所产生的雄性不育系，该不育系的育性稳定、不受环境条件影响、 能够被野生型转基因恢复。该基因 W及该基因突变产生的不育系为构建第H代杂交育种体 系提供了必要的元件，该基因突变产生的雄性不育系，用来生产杂交种子，对于突破并改良 现有的系"和"两系"杂交技术有重要意义。
【附图说明】
[0032] 图1是突变体的表型特征，A:野生型HHZ(左）与突变体ossl25(右）株叶形态； B:皿Z(左）与ossl25(右）小穗结实情况；C:H监花药形态；D:ossl25花药形态；E:H监花 粉染色；F:ossl25花粉染色。
[0033] 图2是SNP位点在水稻染色体上的分布情况。
[0034] 图3是0sS125基因结构及突变位点信息。
[0035] 图4是OsS 125基因在水稻各组织器官中的表达。
【具体实施方式】
[0036] 下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在W本发明技术方案为前提下进行 实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施 例。
[0037] 实施例1.突变体材料的获得
[003引 2011年在深圳采用EMS处理釉稻品种黄华占（处理浓度为0. 7%，处理时间12h)， 建立突变体库，从突变体库中筛选到1份雄性不育突变体OSS125。该突变体的性状经过多 代自交已稳定遗传，在大田条件下观察和比较突变体与野生型整个生长周期植株形态，发 现无明显差异，仅出现花粉不育，最终导致雄性不育性状。本研究所采用的野生型及突变体 的遗传背景均为釉稻品种黄华占。所有水稻材料种植于深圳市作物分子设计育种研究院光 明试验基地，常规管理。
[0039] 实施例2.植株表型鉴定及花粉育性观察
[0040] OSS125突变体在营养生长期与野生型黄华占相比，植株形态上没有明显的差异。 在灌浆后期，野生型黄华占能正常结实，而OSS125突变体最明显的特征就是自然结实率低 (图1A，B)，仅有5%左右，套袋自交结实率为0,说明自然状态下的结实是异花授粉的结果。 解剖观察野生型黄华占与OSS125突变体的成熟颖花，发现突变体的花药略微泛白，雌蕊形 态发育正常（图1C，D)。
[0041] 采用Iz-KI染色方法鉴定水稻花粉育性。在抽穗期，选取已抽出1/3主穗或较大分 藥穗，随机选取穗子中上部未开放的颖花，用綴子将6枚花药取出置于载玻片上，并小必将 花药夹碎使花粉粒释放浸于适量的1 % 1,-KI染液中1~2min，去除花药壁等残留物后置于 光学显微镜下观察并拍照，根据花粉粒形态和染色状况，随机选取5个视野，利用Image J 软件统计不同视野下贿败型和正常染色的花粉数目及所占的比率。染色结果表明，突变体 W贿败型花粉为主，有少量花粉能正常染色（图1E，F)，随机挑选5个视野，分别统计了不同 视野下的花粉染色情况，正常染色的花粉平均约占15%，~85%的花粉为贿败型。
[0042] 实施例3.水稻雄性不育基因克隆
[0043] W OSS125突变体为母本，野生型黄华占为父本，杂交Fl代表现为可育，F2群体 中正常可育植株与不育植株的比率为267:73,卡方（X 2)检验其分离比符合3 : Ux 2 = 1. 95< X 2 (0. 05,壯=1) = 3. 84)，表明OSS125的突变性状由单隐性核基因控制，该基因命 名为 0sS125。
[0044] 将雄性不育突变体材料OSS125与野生型黄华占杂交获得Fi个体，F 1自交获得F 2 分离群体，群体出现表型分离，并从F 2群体中随机取30株具有雄性不育表型的植株，分 别取其叶片提取DM,等量混合后形成DNA池。基因组DNA采用Qiagen DNA提取试剂盒 值化asy Plant Mini Kit,货号：69106)提取，具体操作步骤参见说明书。
[0045] 等量混合突变体DNA，采用超声波方法将其随机片段化，挑选长度为200-3(K)bp 的片段，在两端加上特异的测序接头进行建库，建库方法参考Illumina化ired-End DNA Sample Pr巧kit。之后采用化seq 2000平台进行高通量测序。测序原始数据经过质量监 控，去除低质量（平均质量值<20，或含N〉10%)及接头污染的数据后，利用S0AP2软件化i R Q, Yu C, Li Y R, Lam T W, Yiu S M, Kristiansen K, Wang J.S0AP2:an improved ultrafast tool for shortread alignment. Bioinformatics. 2009, 25 (15) :1966-1967),将数据比对 到日本晴参考基因组（MSU v7)上，筛选比对到染色体唯一位置的短序列，采用SOAPsnp软 件（Xi R Q, Li Y R, Fan邑 X D, Yan H M, Wan邑 J, Wan邑 J. SNP detection for massively parallel whole-genome resequencing. Genome Research. 2009, 19 (6) : 1124-1132)寻找 突变体与日本晴参考基因组间的单核巧酸多态性（SNP)。采用改良的MutMap方法进一步 分析（Abe A, Kosugi S et al. , Genome sequencing reveals agronomicalIy important loci in rice using MutMap.化 1:ure Biotechnology.2012,30(2):174-178;陈竹锋，严 维，王娜，张文辉，谢刚，卢嘉威，简智华，刘东风，唐晓艳.利用改进的MutMap方法 克隆水稻雄性不育基因.遗传.2014, 36 (1) : 85-93)，筛选在突变体OSS125中特异存在而其 他雄性不育突变体中为野生型基因型的SNP位点，通过计算SNP index,挑选基因组上短序 列支持数〉=10且连续分布的高SNP index位点（〉=0. 8)，得到候选区域。针对候选区 域内的高SNP index的位点，综合考虑SNP所在区域及所在基因的功能，确定该SNP是否造 成氨基酸或RNA剪切的变化，最终得到候选位点。
[0046] 在本发明中，高通量测序共获得了 139, 233, 622条短序列（长度为IOObp)，覆盖 整个参考基因组约32. 3X，去除低质量和接头污染的数据，采用比对软件S0AP2, W日本晴 (MSU v7)为参考基因组，将序列比对到参考基因组上，覆盖度为87. 39%，比对上唯一位置 的短序列数目为84, 456, 098。利用SOAPsnp软件寻找突变体与参考基因组之间的单核巧 酸多态性（SNP)，共找到1，382, 732个高质量SNP。采用改良的Mutmap方法进一步分析， 筛选突变体OSS125中特异的SNP位点，计算SNP index值，结合各位点在染色体上的分布 情况（图2)，筛选SNP index〉= 0. 8且连续分布的候选区间，最终在二号染色体得到4个 突变候选位点（表1)。其中H个候选位点位于基因间，仅有一个位于0sS125基因化0C_ 0s02g53680)外显子区。
[0047] 由于候选位点只有一个位于基因的外显子区化0C_0s02巧3680)，其余H个均位于 基因间区，因此将L0C_0s02巧3680作为候选基因进行基因分型验证。随机挑取了 22个雄性 不育单株与44个表型可育单株，利用HRM引物对L0C_0s02巧3680突变区进行特异性扩增， 采用Li曲t Scanner软件分析数据。SNP分型结果（表2)显示该突变位点与不育表