24株于田间，全部取样并提取DNA，用 qWS8Flanking-Rl扩增，寻找基因型为杂合单株，对杂合单株DNA再用30677 (或位点特异性 引物）进行鉴定，确保qWS8存在，对其中一株单株收种，编号为BC3F5-NIL。
[01巧](9)依照8步骤的方法，继续进行了两代鉴定和收种，分步获得BC3F6-NIL和 BC3巧-N比，将BC3F7-NIL种植24株于田间，全部取样并提取DNA，用30677引物（或位点 特异性引物）进行基因型鉴定，将包含qWS8位点单株找出，然后对运些单株DNA用SNP3引 物继续扩增鉴定，挑选出qWS8位点纯和的单株，选取其中一株收种并编号为NIL-WS3(即 Ni 1-WS3A1 Ieles)，而其中杂合单株即为NIL-Hetero Alleles。从不包含qWS8位点的单株 中选取一株收种并编号为NIL-NIP (即Nil-Nip Alleles)。至此近等基因系发展完成，包 含一段约80化的qWS8位点导入片段。ZS97背景NIL采用类似方式获得，见下方"7"的方 法。
[0156] 6、NIP背景下qWS8位点与qPL6位点聚合单株产生
[0157] 步骤同利用qWS8位点进行粗杆大穗品系发展步骤类似，具体修改细节如下：
[015引步骤（1)，似：同上述"4"中的步骤（1)，似。
[0159] (3)由于qPL6和qWS8位于不同的染色体上，故需要增加种植株数至48株W确保 获得足够数目双位点单株，在鉴定时除了使用30677标记（或位点特异性引物），还需要使 用qPL6连锁标记460dCapsl和480dCapsl (表1)进行基因型鉴定，包括PCR扩增，酶切，3% 凝胶电泳，表现为杂合的单株（两条带）即包含qPL6位点，将同时具备qPL6和qWS8的单 株BClFl单株与NIP杂交，成熟后收种，编号为BC2F1。
[0160] (4)~妨在下一季继续种植，依此方法，进一步获得BC3F1单株和BC4F1单株，用 上述S对标记筛选出BC4F1单株中包含qWS8位点和qPL6位点的单株，收种，编号为BC4F2。 [016。 （6)在下一季将BC4F2种子种植48株于田间，对qWS8位点，需要使用30677 (或位 点特异性引物）和SNP3引物确定qWS8位点存在且基因型为杂合（SNP3呈现两条带），而对 qPL6位点，则用460dCapsl和480dCapsl引物进行鉴定，筛选杂合基因型（两条带），依次 方法，找到同时包含qWS8和qPL6基因型为杂合的单株，挑选其中一株，收种，编号为BC4F3。
[0162] (7)同步骤6,将BC4F3播种，鉴定后得到BC4F4种子。
[016引 做将BC4F4播种96株，全部提DNA，用qWS8引物30677(或位点特异性引物）和 SNP3和qPL6引物460dCapsl和480dCapsl对所有单株进行基因型鉴定，同时扩增双亲DNA， 寻找四个引物扩增条带都与WS3 -致的单株，即为qWS8与qPL6的聚合单株，对应图17中 的4株系，而qWS8引物带型与WS3 -致，qPL6引物带型与NIP -致的为只包含qWS8位点 单株，对应图17中的3株系，qWS8带型与NIP-致，而qPL6带型与WS3 -致单株对应图17 中的2株系，所有带型都与NIP -致的对应图17中的1株系。至此聚合株系4发展完成， 其附带株系2和3也表现为增产潜力（图17)。
[0164] 7、利用qWS8位点发展ZS97背景近等基因系
[0165] ZS97背景下近等基因系发展步骤同与NIP背景下近等基因系发展步骤类似，具体 细节如下：
[0166] (1)~（5)步骤同NIP背景发展步骤，但需要将其中NIP亲本换成ZS97, ZS97花 期较NIP还早，所W ZS97可W晚两周种植，然后间隔屯天种植四批。
[0167] (6)将ZS97BC3F2种子种植600株，全部取样并提取DNA，然后利用覆盖qWS8范 围更大的分子标记进行PCR扩增，然后3%琼脂糖凝胶电泳，标记为qWS8Flanking-L2和 qWS8Flanking-R3 (表 2)，同时扩增双亲 DNA(WS3 和 ZS97)，挑选 qWS8Flanking-L2 带型与 ZS97 -致，而qWS8Flanking-R3带型为杂合（两条带）的单株，然后对运些单株DNA继续用 30677标记筛选，挑选其中一株qWS8位点存在的单株收种，编号为ZS97BC3F3。
[0168] (7)在下一季将ZS97BC3F3种植24株于田间，取样提DNA，用30677引物（或位 点特异性引物）进行基因型鉴定，将包含qWS8位点单株找出，然后对运些单株DNA用SNP3 引物继续扩增鉴定，挑选出qWS8位点纯和的单株，选取其中一株收种并编号为NIL-WS3， 对应杂合单株即为NIL-Hetero,而从不包含qWS8位点的单株中选取一株收种并编号为 NIL-ZS97,至此ZS97背景近等基因系发展完成，由于没有继续筛选右侧交换标记，故近等 基因系包含片段较大，但运并未影响qWS8在ZS97背景下对茎粗和穗大小的促进效应（图 14)，如需继续筛选可继续将本步骤中qWS8位点存在，且SNP3为杂合的单株再下一季继续 种植约200株，取样提DNA用SNP3引物和qWS8Flanking-R3引物进行扩增，同时扩增双亲 DNA，寻找SNP3杂合而qWS8Flanking-R3带型与ZS97 -致的个体，然后用30677 (或位点特 异性引物）扩增，确保qWS8存在，所得单株收种，下一季继续种植，再进行30677 (或位点特 异性引物）和SNP3引物鉴定，筛选出包含qWS8区间更小的NIL-WS3和N比-ZS97。
[0169] 表2、用于近等基因系构建筛选交换引物
[0170]
[0171] 8、DNA印迹杂交及位点特异性PCR检测
[0172] DNA印迹杂交需要高质量的DM,故该鉴定方法中使用的DNA采用CTAB法提取。根 据定位区间的序列特征，选取了一系列酶（Fermentas公司）（如图5所示）对双亲DNA进 行单酶切或双酶切消化，酶切体系为400ul，包含20ug DNA，40ul 10 X缓冲液，20ul酶，然 后用水补齐至400ul。酶切条件为37°C，24小时，其中IOul酶为酶切过夜后补加，W确保 酶切完全。酶切完全后，加等体积酪氯仿抽提，离屯、后吸上清，加两倍体积预冷无水乙醇及 1/10体积3M醋酸钢沉淀一段时间后离屯、，倒掉再用70%乙醇洗后即可获得酶切产物，干燥 后用40ul TE buffer溶解。然后进行1%浓度的琼脂糖胶电泳，电压30V，电泳时间10-12小 时。电泳完成后，对琼脂糖胶进行0. 25M盐酸，变性液及中和液处理后即可转膜，所使用膜 为尼龙膜，转膜液为20 X SSC，采用滤纸自然吸附法转膜，转膜装置安放顺序为：转膜槽，滤 纸桥，两层12 X 12滤纸，琼脂糖胶，一张经过水和SSC浸泡过的12 X 12尼龙膜，两层12 X 12 滤纸，大量12X12吸水纸，重物。其中吸水纸要每隔一段时间换一次，转膜14-16个小时。 将所转膜用5 X SSC清洗，然后采用罗氏地高辛系统进行探针及杂交液制备，然后在杂交炉 中进行探针杂交过夜，探针标记及其后步骤参考罗氏地高辛标记试剂盒说明书（PCR DIG Probe Synthesis Kit 和 DIG DNA Labeling and Detection Kit)。
[0173] 其中图5所示探针（Probe)引物为：
[0174] MDTl :5, -AGGGTTGTACCACTGGTAAA-3'（沈Q ID N0:2)，
[01巧]5, -CCATCGTCGGAAAGGGATTT-3,（沈Q ID N0:3);
[0176] MDT3L1 :5, -CCAACCCCCCCTCCCAA-3'（SEQ ID N0:4)，
[0177] 5' -ACGCTGACGCCCTCTCCCT-3'（沈Q ID N0:5);
[0178] MDT3 :5, -GACCTGCCTCCAGTTATCAA-3'（沈Q ID N0:6)，
[0179] 5' -CTTCTCCACCAACATTCTTT-3'（沈Q ID N0:7);
[0180] MDT7 :5' -GGTTTAAGTTTGTGTTCCCC-3'（沈Q ID N0:8)，
[0181] 5,-CCGMTTTATATGAGCTGCTA-3,（沈Q ID N0:9)。
[0182] 位点特异性PCR采用引物扩增WS3DNA特有序列结构，即跨重复序列 边界设计引物，引物序列为：5' -ACAGAGCCTCCATATCTCAG-3'（SEQ ID N0:10)， 5'-GGTAGCAGCACACTATTCCT-3'（SEQ ID N0:11)。PCR 扩增体系为 20ul，采用鼎国 Taq 酶系 统，包括DNA模板，2ul IOX缓冲液，2ul 2mM dNTP，0. 3ul Taq酶，最后用水补齐至20ul。 PCR反应条件为：94°C 3min，然后进行35个循环的94°C 20s，55°C 30s，72°C 20s，最后72°C 延伸5min。
[0183] 9、农艺性状测量方法
[0184] 为了检测qWS8对产量性状的贡献，本发明人检测了包括茎粗，穗茎粗，分葉数，株 高，穗长，穗一级分支数，穗二级分支数，主穗小穗数，种子100粒重，每穗种子粒重，单株产 量。茎粗使用游标卡尺对主茎第=节和第四节中间部分分别量取长轴直径和短轴直径，然 后取平均值。穗茎粗使用游标卡尺直接测量穗轴下部紧连部分茎杆直径。分葉数统计在植 株完全成熟后进行，同时在田间利用带标度竹尺直接测量株高，为地面到最高穗距离。穗长 为主穗从穗轴基部到最末端小穗的距离，不包括芒长。穗一级、二级分支数，种子粒重及小 穗数都从主穗上获得。每穗种子粒重，100粒重及单株产量由电子天平称取获得。茎杆维 管束及壁厚统计方法为：采用徒手切片方法从第=节中间切取薄片，然后用甲苯胺蓝染色， 体视显微镜下拍照获得对应图片，根据图片数对应维管束数目，然后将图片导入image J软 件，并设置标尺，量取茎壁厚度。
[0185] 10、石蜡切片及扫描电镜
[0186] 取穗原基及幼嫩茎用FAA固定，其中石蜡切片样品经过梯度乙醇脱水，及梯度二 甲苯透明，及浸蜡过程，最终将样品包埋到石蜡块中，修块后用莱卡切片机进行切片，切片 厚度为8-lOum，然后展片，贴片并烘干。再用用0. 025%的甲苯胺蓝染色lOmin，清水漂洗干 净后用二甲苯脱蜡，封片后即可到显微镜下观察。扫描电镜样品经过乙醇梯度脱水后，进行 二氧化碳临界点干燥，然后喷金，即可到扫描电镜下观察。
[0187] 11、RNA提取、反转录W及定量PCR检测
[0188] 植物样品取样后放到已加钢珠且无RNA酶污染的管子中，然后立刻放到液氮中速 冻，再利用球磨仪将管子中的植物样品粉碎，加入艾德莱公司的TRIpure RNA提取试剂解 育，其后步骤遵照该试剂说明书进行。mRNA反转录采用iScript CDNA合成试剂盒反应生 成，具体步骤参照对应说明书。小RNA反转录采用TaKaRa公司的SYBR PrimeScript miRNA RT-PCR Kit合成，具体步骤参照对应说明书。然后设计特异引物分别扩增0SSPL14基因，小 RNA miR156 和 miR529p，其中 OsS化 14 基因引物序列为：5' -GACTAGCTGCATCTGTTGGTGAGC-3 ，（沈Q ID N0:12)，5'-TGCTGGCCATGCATTCCTTACG-3'（沈Q ID N0:13)。根据 TaKaRa 试剂盒 要求，小RNA只需合成一条引物，即其序列本身，但需将U替换成T，而另一条为试剂盒内公 用引物，故11111?156引物序列为5'-164〔4644646461646〔4(：-3'669 10側：14)，而11111?529? 引物序列为5'-AGAAGAGAGAGAGTACAGCC-3'(沈Q ID N0:15)。然后采用SYBR试剂标记法进 行PCR扩增，所用试剂为TaKaRa公司的SYBR Premix Ex Taq II TM,反应体系及PCR条件 设置参照对应说明书。采用化pendo计公司realtime PCR仪进行扩增。
[0189] 实施例1、新株型种质发掘及主效基因定位
[0190] 根据国际水稻所对新株型的定义，本发明人在浙江地区种质资源中发现了一种水 稻新型种质，并将其命名为WS3(图IA左）。与对照品种日本晴（Nip图IA右）相比，WS3 茎粗约为0. 7-0. 8cm (图1C-F)，分葉数平均为5个，一级分支高达30个（图1C)，每穗小穗 数超过300个（图1B)，具备典型的新株型特征。因此该种质被用于后续基因挖掘的原始材 料，并与日本晴杂交构建F2群体用于giL分析。
[0191] 通过使用均匀分布于水稻12条染色体上的145个多态性分子标记，本发明人构建 了 190株F2单株的饱和遗传连锁图，结合对应的四组茎粗数据，进行giL分析，最终在8号 染色体（CHR8)检测到一个主效QTL (图2)，该giL被命名为qWS8,置信度LOD约为18-23， 解释了 15-24%的表型变异，单位点遗传效应为0.2-0.