一种高纯度姬松茸多糖的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种高纯度姬松茸多糖的制备方法，属于多糖制备技术领域。本发明将姬松茸粉碎，用氢氧化钠进行预处理后，加入混合酶液，反应后将反应液灭菌灭酶，离心得姬松茸提取液，加入聚丙烯酰胺、硫酸亚铁等除杂除色，再置于二氧化碳超临界萃取仪中进行萃取，得混合溶液，加入马来酸反应，过滤得到滤液，再加入四乙基氢氧化铵反应，并用液氮使溶液降温，经过滤、减压蒸馏、干燥得到高纯度姬松茸多糖。实例证明，本发明操作简便，反应条件温和，整个制备过程中无任何有机溶剂的加入，使得最终制得的姬松茸多糖得率达到了90％以上，纯度不低于95％，为姬松茸多糖在医药领域和保健品行业中的工业化开发奠定了基础。
【专利说明】
一种高纯度姬松茸多糖的制备方法
技术领域
[0001]本发明公开了一种高纯度姬松茸多糖的制备方法，属于多糖制备技术领域。
【背景技术】
[0002]姬松茸又名巴西蘑菇，是一种在我国待开发的药食兼用菌，它原产于北美南部的巴西、秘鲁等地。每100克姬松茸干菇中含有蛋白质占40%?45%、糖类占38%?45%、粗脂肪占3%?4%、粗纤维6.73%及其丰富的维生素和微量元素，作为食品营养丰富。姬松茸含有丰富的生物活性物质，可以作为医药和保健品使用;主要生物活性物质包括多糖类、甾醇类、核酸类、不饱和脂肪酸、食物纤维等，据日本报道，姬松茸的抗癌作用明显优于其他14种有抗癌作用的大型真菌，位居真菌抗癌首位。因此，药用价值受到美食、医学和药学界的极大关注。
[0003]姬松茸多糖是从姬松茸子实体中提取的有效活性成分，其气味芳香，功效显著，有对机体有增强精力的功效，并能抑制肿瘤细胞的生长，具有抗肿瘤作用，在那些无法进行手术也无法使用放射或化学疗法的情况下，它也同样有效，姬松茸及其提取物还可以迅速有效的减轻化学疗法等传统治疗方法所带来的副作用。另外，还具有降血糖、改善糖尿病、降胆固醇、延缓动脉硬化的作用。
[0004]姬松茸多糖除可作为抗病毒性疾病、抗寄生虫、抗排斥和防治肿瘤方面的治疗药剂外，还可作为免疫增强剂提高体液免疫水平，其萃取物能显著促进白细胞介素-6 (IL-6)和干扰素-y (IFN- γ )水平，减少体外和体内IL-4水平，从而对免疫功能进行调节。值得一提的是，姬松茸多糖能够作为免疫佐剂显著增强疫苗的效果，具有相当广阔的应用前景。
[0005]目前，国内外市场上姬松茸多糖主要为含量10?50%的规格，提取方法多采用热水浸提法提取(主要问题是提取效率低、稳定性差)，而多糖纯化方法通常采用乙醇沉淀法、Se vgag法，主要缺点是有机溶剂引入和残留的问题。
【发明内容】
[0006]本发明主要解决的技术问题:针对目前传统方法在制备姬松茸多糖过程中，热水浸提法提取效率低，稳定性差，而乙醇沉淀法、Sevgag法使用大量的有机溶剂，使得产物中溶剂残留量较大的现状，提供了一种高纯度姬松茸多糖的制备方法。该方法将姬松茸粉碎，用氢氧化钠进行预处理后，加入混合酶液，反应后将反应液灭菌灭酶，离心得姬松茸提取液，加入聚丙烯酰胺、硫酸亚铁等除杂除色，再置于二氧化碳超临界萃取仪中进行萃取，得混合溶液，加入马来酸反应，过滤得到滤液，再加入四乙基氢氧化铵反应，并用液氮使溶液降温，经过滤、减压蒸馏、干燥得到高纯度姬松茸多糖。本发明操作简便，反应条件温和，整个制备过程中无任何有机溶剂的加入，使得最终制得的姬松茸多糖得率达到了90%以上，纯度不低于95%，为姬松茸多糖在医药领域和保健品行业中的工业化开发奠定了基础。
[0007 ]为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是:
(I)依次称取10?15g蔗糖、2?4g硝酸钠、I?3gMgS04.7^0、I?3gKCl、0.8?1.0gFeSO4.7H20、10?20g琼脂加入到培养皿中，再加入800?100mL去离子水，搅拌10?20min，制成培养基，培养菌种；
(2)依次接种2?4株木霉、2?4株黑曲霉、2?4株芽孢杆菌到培养基上，在38?40°C，用摇床振荡培养12?14h，将培养液在7000?9000r/min下离心30?40min，弃去上清液，得到混合菌种；
(3)移取10?20%上述混合菌种加入到发酵罐中，再依次加入5?1g葡萄糖、I?3g牛肉膏、200?300mLpH为6.8?7.0磷酸盐缓冲溶液，搅拌10?2011^11，在50?60°(:下，用摇床振荡培养48?50h，将培养液在6000?8000r/min下离心20?30min，弃去下层杂质，得到混合酶液；
(4)称取10?20g干姬松茸，用粉碎机进行粉碎，然后将姬松茸粉末加入到烧杯中，将烧杯置于水浴锅中，控制温度在45?55°C，向烧杯中加入200?300mL0.01mol/L氢氧化钠溶液，搅拌I?2h，再加入上述混合酶液，搅拌反应3?4h，将温度升高至90?100 0C，搅拌10?20min，过滤，得到滤液，即姬松茸提取液；
(5 )向上述姬松鸾提取液中依次加入I?3g聚丙稀酰胺、I?3g硫酸亚铁、I?3g活性炭，搅拌10?20min，过滤，得到滤液，将滤液置于二氧化碳超临界萃取仪中，控制萃取压力为20?30MPa，萃取温度为45?55°C，CO2的流量为25?35kg/h，萃取20?30min，得到混合溶液；
(6)将上述混合溶液加入到烧杯中，将烧杯置于冰水浴中，控制温度在O?5°C，向上述混合溶液中加入I?3g马来酸，搅拌反应I?2h，过滤，得到滤液，向滤液中加入2?4g四乙基氢氧化铵，搅拌反应I?2h，将0.1?0.3L液氮喷淋到烧杯上，使烧杯温度降至-30?-20 °C，搅拌10?20min，过滤，得滤液，即姬松茸多糖溶液，将姬松茸多糖溶液进行减压蒸馏得到白色固体，将白色固体置于95?105 °C烘箱内干燥2?3h，得到白色粉末，即一种高纯度姬松茸多糖。
[0008]本发明的应用方法是:将本发明制得的高纯度姬松茸多糖通过医用制囊机制成姬松茸多糖胶囊，其中每个胶囊中姬松茸多糖中含量为0.1?0.15g，食用时，配以温水口服即可，建议每日早晚食用，每次食用I?3粒，连续食用7?14天，可以对人体免疫功能进行调节，尤其是癌症患者，抗癌效果极其显著，可降低75%以上癌症复发率。
[0009]本发明的有益效果是:
(1)本发明操作简便，反应条件温和，在整个制备过程中无任何有机溶剂的加入，使得最终制得的姬松茸多糖得率达到了90%以上，纯度不低于95%;
(2)本发明制得的姬松茸多糖质量达标，为姬松茸多糖在医药领域和保健品行业中的工业化开发奠定了基础。
【具体实施方式】
[0010]首先依次称取10?15g蔗糖、2?4g硝酸钠、I?3gMgS04.7H20、I?3gKCl、0.8?
1.0gFeSO4.7H20、10?20g琼脂加入到培养皿中，再加入800?100mL去离子水，搅拌10?20min，制成培养基，培养菌种;然后依次接种2?4株木霉、2?4株黑曲霉、2?4株芽孢杆菌到培养基上，在38?40°C，用摇床振荡培养12?14h，将培养液在7000?9000r/min下离心30?40min，弃去上清液，得到混合菌种;接下来移取10?20%上述混合菌种加入到发酵罐中，再依次加入5?1g葡萄糖、I?3g牛肉膏、200?300mLpH为6.8?7.0磷酸盐缓冲溶液，搅拌10?20min，在50?60°C下，用摇床振荡培养48?50h，将培养液在6000?8000r/min下离心20?30min，弃去下层杂质，得到混合酶液;然后称取10?20g干姬松茸，用粉碎机进行粉碎，然后将姬松茸粉末加入到烧杯中，将烧杯置于水浴锅中，控制温度在45?55°C，向烧杯中加入200?300mL0.01mol/L氢氧化钠溶液，搅拌I?2h，再加入上述混合酶液，搅拌反应3?4h，将温度升高至90?100°C，搅拌10?20min，过滤，得到滤液，即姬松茸提取液;之后向上述姬松鸾提取液中依次加入I?3g聚丙稀酰胺、I?3g硫酸亚铁、I?3g活性炭，搅拌10?20min，过滤，得到滤液，将滤液置于二氧化碳超临界萃取仪中，控制萃取压力为20?30MPa，萃取温度为45?55°C，C02的流量为25?35kg/h，萃取20?30min，得到混合溶液；最后将上述混合溶液加入到烧杯中，将烧杯置于冰水浴中，控制温度在O?5°C，向上述混合溶液中加入I?3g马来酸，搅拌反应I?2h，过滤，得到滤液，向滤液中加入2?4g四乙基氢氧化铵，搅拌反应I?2h，将0.1?0.3L液氮喷淋到烧杯上，使烧杯温度降至-30?-20 °C，搅拌10?20min，过滤，得滤液，即姬松茸多糖溶液，将姬松茸多糖溶液进行减压蒸馏得到白色固体，将白色固体置于95?105 °C烘箱内干燥2?3h，得到白色粉末，即一种高纯度姬松茸多糖。
[0011]实例I
首先依次称取1g蔗糖、2g硝酸钠、IgMgSO4.7H20、IgKCl、0.8gFeS04.7H20、10g琼脂加入到培养皿中，再加入800mL去离子水，搅拌1min，制成培养基，培养菌种;然后依次接种2株木霉、2株黑曲霉、2株芽孢杆菌到培养基上，在38 °C，用摇床振荡培养12h，将培养液在7000r/min下离心30min，弃去上清液，得到混合菌种;接下来移取10%上述混合菌种加入到发酵罐中，再依次加入5g葡萄糖、Ig牛肉膏、200mLpH为6.8磷酸盐缓冲溶液，搅拌10?20min，在50°C下，用摇床振荡培养48h，将培养液在6000r/min下离心20min，弃去下层杂质，得到混合酶液;然后称取1g干姬松茸，用粉碎机进行粉碎，然后将姬松茸粉末加入到烧杯中，将烧杯置于水浴锅中，控制温度在45°C，向烧杯中加入200mL0.01mol/L氢氧化钠溶液，搅拌lh，再加入上述混合酶液，搅拌反应3h，将温度升高至90°C，搅拌lOmin，过滤，得到滤液，即姬松茸提取液;之后向上述姬松茸提取液中依次加入Ig聚丙烯酰胺、Ig硫酸亚铁、Ig活性炭，搅拌lOmin，过滤，得到滤液，将滤液置于二氧化碳超临界萃取仪中，控制萃取压力为20MPa，萃取温度为45 V，⑶2的流量为25kg/h，萃取20min，得到混合溶液;最后将上述混合溶液加入到烧杯中，将烧杯置于冰水浴中，控制温度在0°C，向上述混合溶液中加入Ig马来酸，搅拌反应lh，过滤，得到滤液，向滤液中加入2g四乙基氢氧化铵，搅拌反应lh，将0.1L液氮喷淋到烧杯上，使烧杯温度降至-300C，搅拌1min，过滤，得滤液，即姬松茸多糖溶液，将姬松茸多糖溶液进行减压蒸馏得到白色固体，将白色固体置于95°C烘箱内干燥2h，得到白色粉末，即一种高纯度姬松茸多糖。
[0012]本实例操作简便，使用时，将本发明制得的高纯度姬松茸多糖通过医用制囊机制成姬松茸多糖胶囊，其中每个胶囊中姬松茸多糖中含量为0.lg，食用时，配以温水口服即可，建议每日早晚食用，每次食用I粒，连续食用7天，可以对人体免疫功能进行调节，尤其是癌症患者，抗癌效果极其显著，可降低75%癌症复发率。
[0013]实例2
首先依次称取 13g蔗糖、3g硝酸钠、2gMgS04.7H20、2gKCl、0.9gFeS04.7H20、15g琼脂加入到培养皿中，再加入900mL去离子水，搅拌15min，制成培养基，培养菌种;然后依次接种3株木霉、3株黑曲霉、3株芽孢杆菌到培养基上，在39 °C，用摇床振荡培养13h，将培养液在8000r/min下离心35min，弃去上清液，得到混合菌种;接下来移取15%上述混合菌种加入到发酵罐中，再依次加入8g葡萄糖、2g牛肉膏、250mLpH为6.9磷酸盐缓冲溶液，搅拌15min，在55°C下，用摇床振荡培养49h，将培养液在7000r/min下离心25min，弃去下层杂质，得到混合酶液;然后称取15g干姬松茸，用粉碎机进行粉碎，然后将姬松茸粉末加入到烧杯中，将烧杯置于水浴锅中，控制温度在50°C，向烧杯中加入250mL0.01mol/L氢氧化钠溶液，搅拌1.5h，再加入上述混合酶液，搅拌反应3.5h，将温度升高至95°C，搅拌15min，过滤，得到滤液，即姬松茸提取液;之后向上述姬松茸提取液中依次加入2g聚丙烯酰胺、2g硫酸亚铁、2g活性炭，搅拌15min，过滤，得到滤液，将滤液置于二氧化碳超临界萃取仪中，控制萃取压力为25MPa，萃取温度为50°C，⑶2的流量为30kg/h，萃取25min，得到混合溶液;最后将上述混合溶液加入到烧杯中，将烧杯置于冰水浴中，控制温度在3°C，向上述混合溶液中加入2g马来酸，搅拌反应1.5h，过滤，得到滤液，向滤液中加入3g四乙基氢氧化铵，搅拌反应1.5h，将0.2L液氮喷淋到烧杯上，使烧杯温度降至_25°C，搅拌15min，过滤，得滤液，即姬松茸多糖溶液，将姬松茸多糖溶液进行减压蒸馏得到白色固体，将白色固体置于100°C烘箱内干燥2.5h，得到白色粉末，即一种高纯度姬松茸多糖。
[0014]本实例操作简便，使用时，将本发明制得的高纯度姬松茸多糖通过医用制囊机制成姬松茸多糖胶囊，其中每个胶囊中姬松茸多糖中含量为0.13g，食用时，配以温水口服即可，建议每日早晚食用，每次食用2粒，连续食用10天，可以对人体免疫功能进行调节，尤其是癌症患者，抗癌效果极其显著，可降低78%癌症复发率。
[0015]实例3
首先依次称取 15g蔗糖、4g硝酸钠、3gMgS04.7H20、3gKCl、l.0gFeSO4.7H20、20g琼脂加入到培养皿中，再加入100mL去离子水，搅拌20min，制成培养基，培养菌种;然后依次接种4株木霉、4株黑曲霉、4株芽孢杆菌到培养基上，在40 0C，用摇床振荡培养14h，将培养液在9000r/min下离心40min，弃去上清液，得到混合菌种;接下来移取20%上述混合菌种加入到发酵罐中，再依次加入1g葡萄糖、3g牛肉膏、300mLpH为7.0磷酸盐缓冲溶液，搅拌20min，在60°C下，用摇床振荡培养50h，将培养液在8000r/min下离心30min，弃去下层杂质，得到混合酶液;然后称取20g干姬松茸，用粉碎机进行粉碎，然后将姬松茸粉末加入到烧杯中，将烧杯置于水浴锅中，控制温度在55°C，向烧杯中加入300mL0.0Imo 1/L氢氧化钠溶液，搅拌2h，再加入上述混合酶液，搅拌反应4h，将温度升高至100°C，搅拌20min，过滤，得到滤液，即姬松茸提取液;之后向上述姬松茸提取液中依次加入3g聚丙烯酰胺、3g硫酸亚铁、3g活性炭，搅拌20min，过滤，得到滤液，将滤液置于二氧化碳超临界萃取仪中，控制萃取压力为30MPa，萃取温度为55°C，⑶2的流量为35kg/h，萃取30min，得到混合溶液;最后将上述混合溶液加入到烧杯中，将烧杯置于冰水浴中，控制温度在5°C，向上述混合溶液中加入3g马来酸，搅拌反应2h，过滤，得到滤液，向滤液中加入4g四乙基氢氧化铵，搅拌反应2h，将0.3L液氮喷淋到烧杯上，使烧杯温度降至_20°C，搅拌20min，过滤，得滤液，即姬松茸多糖溶液，将姬松茸多糖溶液进行减压蒸馏得到白色固体，将白色固体置于105°C烘箱内干燥3h，得到白色粉末，SP一种高纯度姬松茸多糖。
[0016]本实例操作简便，使用时，将本发明制得的高纯度姬松茸多糖通过医用制囊机制成姬松茸多糖胶囊，其中每个胶囊中姬松茸多糖中含量为0.15g，食用时，配以温水口服即可，建议每日早晚食用，每次食用3粒，连续食用14天，可以对人体免疫功能进行调节，尤其是癌症患者，抗癌效果极其显著，可降低80%癌症复发率。
【主权项】
1.一种高纯度姬松茸多糖的制备方法，其特征在于具体制备步骤为: (1)依次称取10?15g蔗糖、2?4g硝酸钠、I?3gMgS04.7H20、I?3gKCl、0.8?1.0gFeSO4.7H20、10?20g琼脂加入到培养皿中，再加入800?100mL去离子水，搅拌10?20min，制成培养基，培养菌种； (2)依次接种2?4株木霉、2?4株黑曲霉、2?4株芽孢杆菌到培养基上，在38?40°C，用摇床振荡培养12?14h，将培养液在7000?9000r/min下离心30?40min，弃去上清液，得到混合菌种； (3)移取10?20%上述混合菌种加入到发酵罐中，再依次加入5?1g葡萄糖、I?3g牛肉膏、200?300mLpH为6.8?7.0磷酸盐缓冲溶液，搅拌10?2011^11，在50?60°(:下，用摇床振荡培养48?50h，将培养液在6000?8000r/min下离心20?30min，弃去下层杂质，得到混合酶液； (4)称取10?20g干姬松茸，用粉碎机进行粉碎，然后将姬松茸粉末加入到烧杯中，将烧杯置于水浴锅中，控制温度在45?55°C，向烧杯中加入200?300mL0.01mol/L氢氧化钠溶液，搅拌I?2h，再加入上述混合酶液，搅拌反应3?4h，将温度升高至90?100 0C，搅拌10?20min，过滤，得到滤液，即姬松茸提取液； (5)向上述姬松鸾提取液中依次加入I?3g聚丙稀酰胺、I?3g硫酸亚铁、I?3g活性炭，搅拌10?20min，过滤，得到滤液，将滤液置于二氧化碳超临界萃取仪中，控制萃取压力为20?30MPa，萃取温度为45?55°C，CO2的流量为25?35kg/h，萃取20?30min，得到混合溶液； (6)将上述混合溶液加入到烧杯中，将烧杯置于冰水浴中，控制温度在O?5°C，向上述混合溶液中加入I?3g马来酸，搅拌反应I?2h，过滤，得到滤液，向滤液中加入2?4g四乙基氢氧化铵，搅拌反应I?2h，将0.1?0.3L液氮喷淋到烧杯上，使烧杯温度降至-30?-20 °C，搅拌10?20min，过滤，得滤液，即姬松茸多糖溶液，将姬松茸多糖溶液进行减压蒸馏得到白色固体，将白色固体置于95?105 °C烘箱内干燥2?3h，得到白色粉末，即一种高纯度姬松茸多糖。
【文档编号】C12R1/885GK105907831SQ201610484563
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年6月28日
【发明人】郭迎庆, 张明, 孟浩影
【申请人】郭迎庆