产碱菌及其对含铬废水处理的应用
【专利摘要】本发明公开了一种产碱菌及其对含铬废水处理的应用，其为产碱菌Alcaligenes sp.GTM2，所述菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏登记入册的编号为CGMCC No.12347，保藏日期为2016年4月15日。本发明提供的产碱菌GTM2对六价铬具有还原作用：在24h内由1000mg/L降低到110mg/L，还原率为89％；向低浓度(1～50mg/L)六价铬水体中直接投加1％Alcaligenes sp.GTM2菌体具有较强还原能力，还原率为28～56％左右，因此将其用于铬污染水体的修复，可以促进可利用铬向难利用铬的转化，降低铬的毒性。CGMCC No.1234720160415
【专利说明】
产碱菌及其对含铬废水处理的应用
技术领域
[0001 ]本发明涉及环境微生物修复技术领域，特别是涉及一种产碱菌(Al cal igenessp.)及其对含铬废水处理的应用。
【背景技术】
[0002]随全球经济的快速发展，重金属污染问题已经成为越来越重要的环境议题之一。铬虽是人体必需的微量元素，但由于六价铬可穿过原核和真核细胞膜造成氧化性细胞损伤，引起致畸、致癌等病变，故过量的六价铬具有很强的毒性。
[0003]铬盐系列产品是化工-轻工-高级合金材料的重要基础原料，广泛应用于鞣革、电镀、合金、颜料、印染、胶印及农业上。我国每年的铬盐产量已经超过16万吨，而铬渣排放量却在35?42万吨，其含有的六价铬约在3500吨。目前我国已有许多地方相继报道土壤及水体因铬污染而导致人体健康受到危害的案例，因此对铬污染环境的治理变得日益重要，故如何将其还原为低毒性、易利用的三价铬成为铬污染控制的重要单元。
[0004]目前已知将六价铬还原为三价铬的方法主要有化学还原、电化学处理、离子交换和蒸发回收等，但因花费昂贵、效率低下，而且操作复杂，会产生大量有毒污泥，需要进行进一步复杂的处理工序，容易产生二次污染，故难以推广。
[0005]近年来，采用细菌处理Cr(VI)的生物修复方法引起了人们的注意，微生物修复技术是利用微生物自身特点，通过吸附、固定、转化、分解和氧化还原机理来达到污染物治理目的。生物修复方法由于具有成本低廉、操作简便、不会带来二次污染等众多优点而备受关注，诸如中国发明专利(申请号:201210072949.3)中公开了一株苏云金芽孢杆菌YB-03菌株，保藏编号为CGMCCN0.5653，能使Cr (VI)在24h内由100mg/L降低到72mg/L，还原率为28%。然而现有的这些微生物对六价铬抗性较小，尤其是对六价铬浓度超过200mg/L还原能力低，或还原所需时间更长，离工业上高浓度铬污染治理应用还有一定距离。本研究团队申请了一株对高浓度含铬废水(I 000mg/L六价铬)具有较强还原能力的纤维微菌Cellulosimicrobium sp.GTMl (申请号:χχ.x)，在24h内由 1000mg/L降低到 140mg/L，还原率为86%。但是在低浓度含铬废水(1-lOmg/l六价铬)还原率为25?37%左右，对50mg/L六价铬的还原能力仅为10%左右，因此能筛选到对高浓度或低浓度含铬废水均具有较强还原能力的高效菌株成为含铬废水处理的重要生物控制手段。
【发明内容】
[0006]有鉴于此，本发明的目的在于提出一种产碱菌及其对含铬废水处理的应用，以促进可利用铬向难利用铬的转化，尤其是高浓度含铬水体。
[0007]基于上述目的，本发明提供的一种产碱菌，其为产碱菌Alcaligenessp.GTM2，所述菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，保藏登记入册的编号为CGMCC N0.12347，保藏日期为2016年4月15日。
[0008]本发明还提供一种菌剂，所述菌剂包含有上述产碱菌。
[0009]在本发明的一些实施例中，所述菌剂用于还原含铬水体。
[00?0]在本发明的一些实施例中，所述水体中六价络浓度为大于等于500mg/L。
[0011]本发明还提供一种上述产碱菌的对含铬废水处理的应用，所述产碱菌用于还原含铬水体。
[0012]在本发明的一些实施例中，所述水体中六价络浓度为大于等于500mg/L。
[0013]由上面所述可以看出，本发明提供的产碱菌GTM2对六价铬具有还原作用，将其用于铬污染水体的修复，可以促进可利用铬向难利用铬的转化，降低铬的毒性。与现有技术相比，本发明具有如下有益优势:
[0014]Alcaligenes sp.GTM2对高浓度含铬废水(lOOOmg/1六价铬)具有较强的还原能力，在24h内由1000mg/L降低到110mg/L，还原率为89%。
[0015]向低浓度(I?50mg/L)六价络水体中直接投加I%Alcaligenes sp.GTM2菌体具有较强还原能力，还原率为28?56%左右，因此直接施加Alcaligenes spXTM2能够有效对低浓度水体铬污染进行原位修复，且修复成本较低。
【附图说明】
[0016]图1为本发明实施例的Alcaligenessp.GTM2在含铬培养基上的菌落形态；
[0017]图2为本发明实施例的Alcaligenessp.GTM2在扫描电镜下的菌体形态；
[0018]图3为本发明实施例的Alcaligenes sp.GTM2分别在含有1000mg/L的重铬酸钾和不含重铬酸钾的LB中的生长曲线图；
[0019]图4为本发明实施例的Alcaligenes sp.GTM2分别在含有1000mg/L的重铬酸钾的LB中的还原曲线图；
[0020]图5为本发明实施例4中Alcaligenes sp.GTM2分别在含有1、5、10、50mg/L重铬酸钾的水体中的修复效果。
【具体实施方式】
[0021]为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进一步详细说明。
[0022]实施例1产碱菌的筛选、还原能力检测与菌种鉴定
[0023]I)筛选:
[0024]自河南义乌铬矿附近采集含铬废水于4°C保存运输到实验室作为目标菌的筛选材料。
[0025]按照以下配方分别配制高浓度的液体含铬培养基和固体含铬培养基，液体含铬培养基如下:胰化蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g、重铬酸钾(K2Cr207)2.46g摇动容器直至溶质溶解，用5mol/L NaOH调pH至7.0，用去离子水定容至1L，在121°C高压下蒸汽灭菌20min。固体含络培养基和液体含络培养基一样，加入15g琼脂粉即可。
[0026]在150mL液体含铬培养基中加入3mL的含铬废水，于37°C，150r/min培养96h后选取3mL的培养液转接到150mL液体含铬培养基于37°C，150r/min继续培养96h;选取培养液中ImL，涂布于含有固体含铬培养基中，放入37 °C培养48h。
[0027]挑选分离得到5株原始菌株，然后依次编号保存。
[0028]2)还原能力检测:采用加入外源重铬酸钾(K2Cr2O7)的方法来模拟六价铬污水，加入的重铬酸钾的量为2462mg/L，对应六价铬的量为1000mg/L。通过设置空白对照、微生物对照等两种对照组来研究微生物的铬还原效果(每组2个重复)。
[0029]具体地，将各菌种分别接种于IL的LB培养基中(30°C，180rpm)摇床培养48h，离心收集菌体细胞并用磷酸盐缓冲液(0.02M;pH=7)配置OD6qq的值为0.2的菌悬液，然后将菌悬液以1%的接种量接种于预先准备的200mL含重铬酸钾(2000mg/L)的LB培养基中(不加菌的空白对照处理中只加入相应比例的无菌水)摇床培养(37°(:，180印111)。7211后对水样中剩余的六价铬浓度进行测定，最终确定出细菌GTM2对六价铬具有最明显的去除效果，还原率超过 50 %。
[0030]3)菌种鉴定:提取菌株GTM2的总DNA，用通用引物27FW -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-37 )和HgSRG'-TACGGCTACCTTGTTACGACm')扩增 16S rDNA片段 16S rDNA的，测序结果如下(Alcaligenes sp.GTM2的 16S rDNA基因序列信息):
[0031]CTTTACCATGCAGTCGAACGGCAGCACGAGAGAGCTTGCTCTCTTGGTGGCGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATATATCGGAACGTGCCCAGTAGCGGGGGATAACTACTCGAAAGAGTGGCTAATACCGCATACGCCCTACGGGGGAAAGGGGGGGATTCTTCGGAACCTCTCACTATTGGAGCGGCCGATATCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCTCACCAAGGCAACGATCCGTAGCTGGTTTGAGAGGACGACCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTGGACAATGGGGGAAACCCTGATCCAGCCATCCCGCGTGTATGATGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTTGGCAGAGAAGAAAAGGTATCTCCTAATACGAGATACTGCTGACGGTATCTGCAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGTGTAGGCGGTTCGGAAAGAAAGATGTGAAATCCCAGGGCTCAACCTTGGAACTGCATTTTTAACTGCCGAGCTAGAGTATGTCAGAGGGGGGTAGAATTCCACGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGATATGTGGAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCCCCTGGGATAATACTGACGCTCAGACACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAACTAGCTGTTGGGGCCGTTAGGCCTTAGTAGCGCAGCTAACGCGTGAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGATGATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCTACCCTTGACATGTCTGGAATGCCGAAGAGATTTGGCAGTGCTCGCAAGAGAACCGGAACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCATTAGTTGCTACGCAAGAGCACTCTAATGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTATGGGTAGGGCTTCACACGTCATACAATGGTCGGGACAGAGGGTCGCCAACCCGCGAGGGGGAGCCAATCTCAGAAACCCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGAATGTCGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTTCACCAGAAGTAGGTAGCCTAACCGTAAGGAGGGCGCTACCACG
[0032]与NCBI数据库进行序列相似性比对，初步鉴定出菌株GTM2属于Alcaligenes sp.菌属，相似度为99%。及经16S rDNA比对确定为Alcaligenes sp.GTM2。
[0033]4)菌种保藏:发明人将筛选得到的对铬修复具有明显效果的菌株命名为Alcaligenes sp.GTM2，并于2016年4月15日送交中国普通微生物菌种保藏管理中心进行专利保藏，其保存号为CGMCC N0.12347。
[0034]实施例2Alcaligenes spXTM2的生物学特性:
[0035]革兰氏染色显阴性，具有运动性。菌株Alcaligenes sp.GTM2在固体培养基平板上呈现直径1.0?1.5mm，圆形，乳白色不透明，有粘性，边缘整齐的菌落形态，如图1所示。在扫描电镜下观察结果如图2(A)所示，图像显示Alcaligenes sp.GTM2菌体细胞长约2?3μηι，宽
0.5?]^111，不产生抱子;经过100011^/1^的0(￥1)处理处理4811后，410&1丨861168 sp.GTM2表面呈现凹凸不平，如图2(B)所示。
[0036]该菌株的保存方法是:采用50%的甘油与等体积的菌株混匀保存于_80°C冰箱中。
[0037]实施例3Alcaligenes sp.GTM2菌株对高浓度含铬废水(lOOOmg/1六价铬)的还原实验
[0038]将Alcaligenes sp.GTM2接入200mL LB培养液中(LB配方:胰蛋白胨10g/L;酵母提取物 5g/L;氯化钠 10g/L;pH = 8.0; 121<€灭菌20111；[11)，经过夜活化后 Al cal igenes sp.GTM2的活菌数可达1.0X108CFU/毫升以上，，按l/100(v/v)接种量分别转接至500mL含有1000mg/L六价铬和不含六价铬的新鲜灭菌LB培养基中，38°C，180rpm摇床培养，每隔8h取样，用血球计数板计数，绘制GTM2在重铬酸钾浓度1000mg/L和不含重铬酸钾的培养条件下的生长曲线，如图3所示。同时用硫酸亚铁铵滴定法和采用二苯碳酰二肼分光光度法检测溶液中总铬与Cr (VI)浓度变化，如图4所示。
[0039]具体方法为:将所取水样离心(8000rpm，20min)获得上清液。继而用二苯碳酰二肼分光光度法检测其中的六价铬含量(参照中华人民共和国国家标准，标准号GB/T7467-1987，水质六价铬的测定二苯碳酰二肼分光光度法，国家环境保护局，1987-03-14，中国标准出版社，1987-07-01)，对所测数据进行换算即可得到水样中六价铬的含量。
[0040]结果显示:(I)Alcaligenessp.GTM2可在营养盐丰富的含铬废水中实现大量增殖，活菌数达到1.5\1090?1]/毫升以上；(2从1(^1丨861168 sp.GTM2具有较强的铬还原能力，能使Cr(VI)在8h内由1000mg/L降低到400mg/L，还原率为60% ;能使Cr(VI)在16h内由1000mg/L降低到200mg/L，还原率为80 % ；能使Cr (VI)在24h内由1000mg/L降低到110mg/L，还原率为89%。因此该菌种在添加部分营养盐后具有处理高浓度含铬废水的工程化应用基础。
[0041 ] 实施例4Alcaligenes sp.GTM2对低浓度含铬废水(I?50mg/L六价铬)的还原实验
[0042]将本发明中Al cal igenes sp.GTM2菌悬液(0D6QQ的值为0.2的菌悬液)，再按I/100(v/v)接种量将菌悬液分别转接至200mL含有l、5、10、50mg/L Cr(VI)的自来水中(每组3个平行)，38°C，180rpm摇床培养，48h后离心测得溶液中剩余六价铬的浓度，并计算六价铬的去除率，如图5所示:Alcaligenes sp.GTM2对低浓度铬(I?50mg/L)六价铬具有较强还原能力，还原率为28?56 %左右。因此施加Alcaligenes sp.GTM2能够有效对低浓度水体铬污染进行原位修复。
[0043]由此可见，与现有技术相比，本发明具有如下有益优势:
[0044]Alcaligenes sp.GTM2对高浓度含铬废水(lOOOmg/1六价铬)具有较强的还原能力，在24h内由1000mg/L降低到110mg/L，还原率为89%。
[0045]向低浓度(I?50mg/L)六价络水体中直接投加I%Alcaligenes sp.GTM2菌体具有较强还原能力，还原率为28?56%左右，因此直接施加Alcaligenes spXTM2能够有效对低浓度水体铬污染进行原位修复，且修复成本较低。
[0046]所属领域的普通技术人员应当理解:以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子;在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种产碱菌，其特征在于，其为产碱菌Alcal igenes sp.GTM2，所述菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，保藏登记入册的编号为CGMCC N0.12347，保藏日期为2016年4月15日。2.—种菌剂，其特征在于，所述菌剂包含有如权利要求1所述的产碱菌。3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂用于还原含铬水体。4.根据权利要求3所述的菌剂，其特征在于，所述水体中六价铬浓度为大于等于500mg/L05.—种根据权利要求1所述的产碱菌的对含铬废水处理的应用，其特征在于，所述产碱菌用于还原含铬水体。6.根据权利要求5所述的产碱菌的对含铬废水处理的应用，其特征在于，所述水体中六价络浓度为大于等于500mg/L。
【文档编号】C12N1/20GK106011009SQ201610426026
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月15日
【发明人】庄绪亮, 徐圣君, 高天明, 金德才, 白志辉, 庄国强
【申请人】中国科学院生态环境研究中心