专利名称：：一种用于水中农药残留去除的颗粒剂制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种颗粒剂制备方法，尤其是用于水中农药残留去除的颗粒剂制备方法。
背景技术：
：我国以占世界7%的耕地面积养活着世界22%的人口，取得了巨大成就。其中农药的防治作用功不可没。但由于农药生产管理上的落后，所带来的生态环境污染损失也高达50多亿元，特别在广大农村，一些经济欠发达地区的农村仍在使用一些有害的、禁用的农药，如節T等；一些有机磷农药真正用于毒杀病虫害的量仅占施用量的10%-2()%，其余大部分的农药都残留在蔬菜水果表面，或者渗入土壤、水和空气中使一些原始生态系统受到损害，造成大面积的农业生态污染；同时，农药在生产、流通及使用领域中也存在意外泄漏。当前受农药污染较重的食品有蔬菜、水果、肉类、蛋类、食油、家禽、粮食、水产品等；其中蔬菜、水果、地下水的污染对人的危害最为直接而严重；而且由于水体的循环作用，水体中的农药残留会造成污染的扩散，使得土壤、农作物及养殖动物等的农药本底数提高，成为影响人民的身体健康的主要因素之一。中国专利申请(申请号200410042712.6)针对水中农药残留问题，提供了重组菌fco〃BL-21(DE3)携带质粒pETDuet-叩d-bl，利用该菌经发酵、诱导、提取后得到的酶粉(包括有机磷水解酶和羧酸酯酶)，对于降解水中农药残留具有明显效果。然而，酶粉的使用方式对于农药降解的效果也有较大影响，如果直接使用酶粉泼洒方式，自来水厂、食品饮料厂、果蔬加工厂的水处理设备前需要加装一个处理水池，进行脱毒反应，该反应只能是间隙式的，无法连续生产；而用直接泼洒酶溶液方式，虽然也能降解农药，但由于酶的本质是蛋白质，容易受到环境微生物的降解，稳定性不高，降低了降解效果。
发明内容本发明的目的是克服上述
背景技术：
的不足,提供一种农药解毒酶颗粒剂的制备方法，该方法具有工艺简单、操作方便的特点；所制成的颗粒剂应具有降解水中农药残留的功能，并且降解效果好、贮存安全和使用方便。本发明采用的技术方案是一种用于水中农药残留去除的颗粒剂制备方法，依次包括以下步骤1)制取每克1000IU的标准化酶粉在重组菌f.co〃BL-:"(DE3)携带质粒pETDue1:-opd-bl表达得到的原酶粉中，按下列公式加入凹凸棒土Y=XA/1000-X其中A:为原酶粉活性单位；X:为原酶粉重量(克)；Y:为需要加入的凹凸棒土的重量(克)；2)配制酶溶液(以1()0重量份计)，称取2份标准化酶粉，加入2—6份凝胶剂、l份硅藻土，加入91一95份的0.2M的pH8.5的磷酸缓冲液，搅拌均匀；3)凝固液配制凝固液为2—5重量百分比的氯化钙溶液，凝固液与酶溶液的重量比为8-12:1;4)颗粒剂成形用常规农用喷雾器将酶溶液喷入凝固液中，喷雾器压力2.05mpa-2.3mpa(绝对压力)，固化时间O.5-2小时后，进行固液分离；5)干燥将分离得到的颗粒冷冻干燥，冻结温度一45。C-5(TC，升华温度小于45度。所述的凝胶剂是海藻酸钠或、和卡拉胶。所述的喷雾压力是2.lmpa(绝对压力)。本发明提供的活性颗粒，可以装柱后形成脱毒柱串连接入自来水厂、食品饮料厂、果蔬加工厂的水处理设备，可以保证生产的连续性，而且设备的兼容性非常好，对柱的外形、接口尺寸没有特殊要求，仅需按流量对容积作出要求。也可以直接泼洒到河流、湖泊、池塘等遭受农药残留污染的水域，使用方便。本发明的有益效果是所采用的方法简单实用；采用的均为常规设备，加工成本较低；所获得的颗粒剂成品使用方便，又便于贮存；选用的均为常规材料，来源广阔容易获得，又价格低廉。图1是流出液甲基对硫磷农药残留测定示意图。图2是甲胺磷及乐果对硫磷农药残留测定示意图。图3是室温下的酶稳定性试验效果示意图。图4是4'C下的酶稳定性试验效果示意图。具体实施例方式一种用于水中农药残留去除的颗粒剂制备方法，依次包括以下步骤1)制取每克1000IU的标准化酶粉所述的标准化酶粉是在通过工程菌表达得到的原酶粉(有机磷水解酶和羧酸酯酶混合冻干物)中，按下列公式加入凹凸棒土(即凹凸棒石粘土)后得到Y=XA/1000-X其中A为原酶粉活性单位；X为原酶粉重量(克)；Y为需要加入的凹凸棒土的重量(克)；有机磷水解酶和羧酸酯酶混合冻千物(有机磷水解酶与羧酸酯酶可以是任意比例)可外购获得，也可自制(通过一级菌种、二级菌种培养制取)；其菌种为重组菌￡co〃BL-21(DE3)携带质粒pETDuet-opd-bl，由中国科学院动物研究所提供。2)配制酶溶液(以100重量份计)称取2份标准化酶粉，加入2—6份凝胶剂、l份硅藻土，加入91一95份的0.2M的pH8.5的磷酸缓冲液，搅拌均匀；凝胶剂推荐采用海藻酸钠或、和卡拉胶。3)凝固液配制凝固液为2%—5%重量比的氯化钙溶液(氯化钙水溶液)，重量为酶溶液的8-12倍；4)颗粒剂成形用常规农用喷雾器将酶溶液喷入凝固液中，调整喷雾压力l.05mpa-1.3mpa(可以得到不同大小的颗粒；喷雾压力l.lmpa，可以得到20—40目的细颗粒。)，固化时间0.5-2小时后，进行固液分离；5)干燥将分离得到的颗粒冷冻干燥，冻结温度一45'C-5(TC。在冻干过程中，为了提高效率，可以对物料进行适度加温，以提供水分蒸发所需的能量；在此升华过程中，物料温度小于45度。由此获得具有降解水中农药残留功效的颗粒剂。实施例l1、取1克酶活为2000IU的酶粉，加入1.0克的凹凸棒土，混合均匀，得到2克标准化酶粉。2、取2克上述标准化酶粉，加上2克胶凝剂(1.75克海藻酸钠，0.25克卡拉胶)，加上l克硅藻土，加上95克0.2M的pH8.5的磷酸缓冲液，搅拌均匀，形成悬浊液。3、另配制2%氯化钙溶液1000毫升，置于敞口容器中。4、将2制取的含酶的悬浊液置于小型喷雾器内，将其喷入凝固液内，喷雾压力1.05mpa，静止30分钟，得到IO目的淡黄色凝胶颗粒。5、用60目筛网分离凝胶颗粒，放在不锈钢盘内，一45。C预冻后放入冷冻干燥机冻干，过程温度低于45。C;得到4.9克干燥疏松颗粒。测定，其酶活性为360IU/克，总回收率为88.2%。实施例21、取O.8克酶活为250.011)的酶粉，加入1.2克的凹凸棒土，混合均匀，得到2克标准化酶粉。2、取2克上述标准化酶粉，加上6克胶凝剂(4克海藻酸钠，2克卡拉胶)，加上l克硅藻土，加上91克0.2M的pH8.5的磷酸缓冲液，搅拌均匀，形成悬浊液。3、另配制5%氯化钙溶液1000毫升，置于敞口容器中。4、将2制取的含酶的悬浊液置于小型喷雾器内，将其喷入凝固液内，静止120分钟，喷雾器压力2.lmpa(绝对压力)，得到20目的淡黄色凝胶颗粒。5、用60目筛网分离凝胶颗粒，放在不锈钢盘内，一45。C预冻后放入冷冻干燥机冻干，过程温度低于45'C;得到4.8克干燥疏松颗粒。经测定，其酶活性为390IU/克，总回收率为93.6%。实施例31、取0.8公斤酶活为2500IU/克的酶粉，加入1.2公斤的凹凸棒土，混合均匀，得到2公斤标准化酶粉。2、取2公斤上述标准化酶粉，加上4公斤胶凝剂(3公斤海藻酸钠，l公斤卡拉胶)，加上l公斤硅藻土，加上93公斤0.2M的pH8.5的磷酸缓冲液，搅拌均匀，形成悬浊液。3、另配制2.5%氯化钙溶液1000升，置于敞口容器中。4、将2制取的含酶的悬浊液置于喷雾器内，将其喷入凝固液内，喷雾器压力2.3mpa(绝对压力)，静止60分钟，得到40目的淡黄色凝胶颗粒。5、用100目筛网分离凝胶颗粒，放在不锈钢盘内，一45。C预冻后放入冷冻干燥机冻干，过程温度低于45'C;得到4.8公斤干燥疏松颗粒。经测定，其酶活性为370IU/克，总回收率为88.8%。上述实施例得到的颗粒剂降解水中农药试验试验一取实施例3所得的活性颗粒5克，装20厘米柱，柱直径1厘米，室温30°C，自来水配制100ppm的甲基对硫磷溶液上柱。流速为5毫升/分种，每50毫升为一个样，以胆碱酯酶抑制率法测定流出液的农药残留，按国家标准，抑制率小于50%为农药阴性，试验结果如下由图1可知，5克活性颗粒，可以在一定条件下每分钟降解5毫升含100ppm甲基对硫磷的自来水，降解后的胆碱酯酶抑制率仅为5%左右，可以认为完全讲解。按以上同样方法，将100ppm甲基对硫磷换成]0ppm的甲胺磷和乐果，溜出速度为l毫升/分，试验该活性颗粒对甲胺磷及乐果的降解效果，结果如图2所示。该结果表明，活性颗粒对甲胺磷和乐果同样具有降解效果。上述实施例得到的颗粒剂的酶稳定性试验将实施例得到的颗粒剂放入塑料袋室温及冰箱保藏，定期取出测定单位酶活。由图3所示的室温下的酶稳定性结果以及图4所示的4"C下的酶稳定性结果可知，该颗粒剂在室温下保藏一年后，活性还能保持64.9%，在冷藏下能保持85%的活性，达到了实际使用要求。附录酶活性测定方法(企业标准Q/ZJTL002-2007):有机磷水解酶活力测定A.1原理有机磷水解酶能够将有机磷农药降解为对硝基酚，后者表现为稳定的黄色，在410nm波长下有吸收峰。在一定的浓度范围内，在一定的浓度范围内，对硝基酚的浓度与其在410nm波长下的吸光度(A410)成正比，即在此范围内测定其A410即可得到其对应的浓度。在指定的反应体系内，样品中的酶将底物(甲基对硫磷)分解为对硝基酚，单位时间内的A410增加值代表了单位时间内有机磷水解酶水解甲基对硫磷生成对硝基酚的能力，按照活力单位的定义，即可计算出酶的活性。A.2仪器a)带动力学试验(时间扫描)功能的紫外可见分光光度计；b)lml移液管；c)各类玻璃器皿；d)O.lmg电子天平；e)温度计。A.3试剂与溶液a)2mMPNP;b)100P1甲醛或乙醇配制的1000PPM的甲基对硫磷(终浓度为100PPM);c)50mM磷酸缓冲液。A.4测定步骤A.4.1绘制对硝基苯酚(PNP)标准曲线A.4.1.1配置2mMPNP标准溶液。A.4.1.2分别在试管中各加2mMPNP0.0+0.06,0.08，0.10，0.12,0.14ml，以50mM磷酸缓冲液(pH=7.0)补足体积至2ml，以不加PNP作为空白对照。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>磷酸缓冲液2.01.961.941.921.901.881.86(ml)终浓度OM)0406080100120140A.4.1.3在37。C下，用lcm光径的比色杯测0D4H)(波长为410nm的吸光值)，以横坐标为标准PNP浓度，纵坐标为吸光值绘制对硝基酚(PNP)标准曲线图。A.4.1.4求出标准曲线斜率Id(1/uM)。A.4.2MPH酶活测定:lml反应体系中含100pl甲醛或乙醇配制的1000PPM的甲基对硫磷(终浓度为100PPM)，100ul经过一定稀释的样品，以50mM磷酸缓冲液(pH=7.0)补足lml体积，于分光光度计在37'C下测定0D训时酶动力曲线，(即吸光值对时间的动态曲线)，任意选择直线期上具有代表性的的两个点计算吸光值OD对时间t(以分钟计)的斜率K"即K产(OD厂ODj/(t厂ti)。A.5结果计算MPH的活力单位为U二K2/IdX稀释倍数X1.0(100ul样品，相当于稀释10倍)，反应体系中，每分钟生成PNP的umol数。羧酸酯酶B1的活性测定B.1原理羧酸酯酶B1能降解羧酸酯类物质--如e-乙酸萘酯产生e-萘酚，P-萘酚与显色剂有稳定的成色反应，在555mn波长下有吸收峰。在一定的浓度范围内，P-萘酚的浓度与其在555imi波长下的吸光度(A555)成正比，即在此范围内测定其A555即可得到其对应的浓度。在指定的反应体系内，样品中的酶将底物(P-乙酸萘酯)分解为P-萘酚，单位时间内的A555的增加值代表了单位时间内羧酸酯酶水解e-乙酸萘酯生成对e-萘酚的能力，按照活力单位的定义，即可计算出酶的活性。B.2仪器a)带动力学试验(时间扫描)功能的紫外可见分光光度计；b)lml移液管；c)各类玻璃器皿；d)O.lmg电子天平；e)水浴锅；f)温度计。B.3试剂与溶液a)丙酮(分析醇)；b)2mMP-萘酚；c)50mM磷酸缓冲液；d)0.03M的P-乙酸萘酯;e)lOOmg固蓝B盐，10mlDDW,25ml5%SDS(十二烷基硫酸钠)，充分混匀后离心去除杂质配制出的显色剂。B.4测定步骤B.4.1绘制P-萘酚标准曲线图B.4.1.1分别在试管中加入以下试剂做标准曲线。管号CK12345丙酮(ul)30241812602mM3-萘酚(ul)0612182430终浓度(mM)00.40.81.21.62.0B.4.1.2各加lml0.2M(pH7.0)磷酸缓冲液，并加O.5ml显色剂，在37。C下，用lcm光径的比色杯测0D5S5(波长为555nm的吸光值)，以横坐标为标准J3-萘酚浓度，纵坐标为吸光值，绘制P-萘酚标准曲线图。B.4.1.3求出标准曲线斜率Ki。B.4.2羧酸酯酶B1的活性测定B.4.2.1样品测试管中加30"10.03M的J3-乙酸萘酯，经过适当稀释的样品，并加0.2M(pH7.0)磷酸缓冲液lral。B.4.2.237。C水浴10min。B.4.2.3将试管置于冰上以终止反应，.并加0.5ml显色剂后立即测定。B.4.2.4于分光光度计在37。C下测定0D5i;(波长为555nra的吸光值)时酶动力曲线，(即吸光值对时间的动态曲线)，任意选择直线期上具有代表性的的两个点计算吸光值OD对时间t(以分钟计)的斜率K2，即K^(0D2-0Dl)/(t2-t')。B.5结果计算酯酶的活力单位为U二K2/IdX稀释倍数，即反应体系中，每分钟生成P-萘酚的Umol数。权利要求1、一种用于水中农药残留去除的颗粒剂制备方法，依次包括以下步骤1)制取每克1000IU的标准化酶粉在重组菌E.coliBL-21(DE3)携带质粒pETDuet-opd-b1表达得到的原酶粉中，按下列公式加入凹凸棒土Y＝XA/1000-X其中A为原酶粉活性单位；X为原酶粉重量(克)；Y为需要加入的凹凸棒土的重量(克)；2)配制酶溶液(以100重量份计)称取2份标准化酶粉，加入2—6份混合凝胶剂、1份硅藻土，加入91—95份的0.2M的pH8.5的磷酸缓冲液，搅拌均匀；3)凝固液配制凝固液选用重量百分比为2—5的氯化钙溶液，凝固液与酶溶液的重量比为8-12∶1；4)颗粒剂成形用常规农用喷雾器将酶溶液喷入凝固液中，喷雾器压力2.05mpa-2.3mpa，固化时间0.5-2小时后，进行固液分离；5)干燥将分离得到的颗粒冷冻干燥，冻结温度—45℃～-50℃，升华温度小于45度。2、根据权利要求l所述的一种用于水中农药残留去除的颗粒剂制备方法，其特征在于所述的凝胶剂是海藻酸钠或、和卡拉胶。3、根据权利要求1或2所述的一种用于水中农药残留去除的颗粒剂制备方法，其特征在于所述的喷雾压力是2.lmpa。全文摘要本发明涉及一种颗粒剂制备方法。目的是提供一种农药解毒酶颗粒剂的制备方法，该方法具有工艺简单、操作方便的特点；所制成的颗粒剂应具有降解水中农药残留的功能，并且降解效果好、贮存安全和使用方便。技术方案是一种用于水中农药残留去除的颗粒剂制备方法，依次包括以下步骤1)制取每克1000IU的标准化酶粉，2)配制酶溶液，3)凝固液配制，4)颗粒剂成形，5)干燥。文档编号C02F3/00GK101428897SQ20081016348公开日2009年5月13日申请日期2008年12月22日优先权日2008年12月22日发明者杨志坚,罗天生,高振岭申请人:浙江天龙生物工程有限公司