专利名称：一种应用于治理微污染水体的异养硝化菌的筛选方法
技术领域：
本发明涉及一种应用于治理微污染水体的异养硝化菌的筛选方法。
背景技术：
随着工农业生产的发展和人民生活水平的提高，含氮化合物的排放量急剧增加，已成为环境的主要污染源，引起各界的关注。传统理论认为生物硝化是由两组自养型硝化细菌-亚硝酸细菌和硝酸细菌，将氨态氮转化为硝态氮的生化反应过程。两类自养硝化细菌都是严格的自养细菌，均需要严格的好氧环境。在硝化反应过程中，混合液有机物浓度较高时会使增殖速度较高的异养型细菌迅速增殖，从而使自养型的硝化菌得不到优势不能成为优势种属。这两类细菌对酸性环境很 敏感，一般都在微碱性的环境中生长良好，亚硝化细菌生长的PH范围是7 9，硝化细菌为pH 5 8,当pH < 5时硝化作用便全部停止。异养硝化概念中认为氨氮不仅可以由自养硝化细菌来完成，某些异养硝化细菌也可以进行对氨氮的氧化作用。相对于自养硝化细菌而言，异养硝化细菌虽有较低的分解效率，但是，由于它在环境中的数量上往往远大于自养硝化细菌，因此，在某些环境之中异养硝化作用的贡献可以与自养硝化细菌相当甚至超出。异养硝化技术具有以下几个优点(I)能够同时去除氨氮和COD ； (2)应用于微污染水体的异养硝化菌生长繁殖速率高，对环境适应能力强，可以缩短处理时间提高处理效果；(3)氨氮浓度较低的情况下仍有高效的氨氮去除效果。
发明内容
基于异养硝化菌在微污染水体处理过程中的作用，本发明的目的在于提供一种应用于治理微污染水体的异养硝化菌的筛选方法，以为微污染水体的处理提供有效的微生物源。为实现上述技术任务，本发明采取如下的技术解决方案一种应用于治理微污染水体的异养硝化菌的筛选方法，其特征在于，该方法按下述步骤进行步骤一，从微污染水体中取底泥，将所取底泥在25°C下于液体培养基中培养驯化十五天，得到驯化后的活性底泥，其中底泥与液体培养基的体积比为1 (10 20);培养驯化过程中每三天更换一次液体培养基，每次更换时所使用的液体培养基不同，所用的液体培养液按照更换次序依次为配水培养液、3体积的配水培养液与I体积的灭菌微污染水体组成的液体培养基、2体积的配水培养液与I体积的灭菌微污染水体组成的液体培养基、I体积的配水培养液与I体积的灭菌微污染水体组成的液体培养基、灭菌微污染水体；所述的配水培养液的配方为乙酸钠0.5g，
NH4Cl 0. lg,KH2PO4 0. lg,MgSO4 · 7H20 0. 05g,CaCl2 0. 05g,微量元素溶液2ml,蒸馏水IOOOmL;步骤二，以SYL固体培养基作为分离纯化培养基，依次采用平板稀释法与平板划线法对驯化后的活性底泥内的生物菌群进行分离纯化，得到纯化细菌；
所述的SYL固体培养基的配方为乙酸钠0.5g,NH4Cl 0. lg,KH2PO4 0. lg,MgSO4 · 7H20 0. 05g,CaCl2 0. 05g,琼脂18g，蒸馏水IOOOmL;步骤三，对分离纯化得到的各细菌分别进行初筛，初筛方法为将待初筛的细菌菌落接种于SYK培养液中后在25°C、120rpm的条件下于空气振荡器中培养4d,同时在培养过程中，采用纳氏试剂比色法对培养中的细菌的氨氮去除率进行检测，其中氨氮去除率达70 %以上的细菌菌株为初筛得到的异养硝化细菌，所述SYK培养液的配方为乙酸钠0.05g,NH4Cl 0. Olg,KH2PO4 0. Olg,MgSO4 · 7H20 0. Olg,CaCl2 0. Olg,蒸馏水IOOOmL;步骤四，对初筛得到的异养硝化细菌分别进行复筛，复筛方法为将待复筛的异养硝化细菌接种于复筛培养液中后在25°C、120rpm的条件下于空气振荡器中培养48小时，同时在培养过程中，采用纳氏试剂比色法对培养中的异养硝化细菌的氨氮去除率进行检测，其中氨氮去除率达80%以上的异养硝化细菌为应用于治理微污染水体的异养硝化细菌，所述复筛培养液的配方为微量元素溶液2mL,灭菌微污染水IOOOmL ;所述微量元素溶液为以质量浓度计，I. Og/L EDTA、0. 2g/L ZnSO4,0. lg/LMnCl2 · 4Η20、0· 5g/L FeSO4 · 7Η20、0· 5g/L CuSO4 · 5Η20、0· 2g/L CoCl2 · 6H20 的水溶液。本发明采取逐步驯化底泥的方法富集应用于微污染水体的异养硝化细菌群，即逐步减低营养物浓度的方式使异养硝化菌成为优势菌群，从而达到富集驯化的目的；接着采用“SYL固体培养基”对驯化后得到的活性污泥内的生物菌群采用平板稀释法与平板划线法分离和纯化；然后采用“SYK液体培养基”对分离、纯化后得到的纯菌进行初筛，得到对氨氮去除率达70%以上的菌株；最后采用灭菌的微污染水体添加微量元素溶液作为处理对象对初筛后的菌株进行复筛，得到应用于微污染水体的异养硝化菌，以有效解决微污染水体的水质恶化问题。
图I为实施例I中的YZXll和YZX16菌株的除氮能力的效果示意图；其中纵轴坐标代表氨态氮的浓度；图2为实施例I中分离得到的YZXll和YZX16菌株的系统发育分析图。以下结合实施例与附图对本发明作进一步详细说明。
具体实施方式
以下是发明人提供的具体实施例，需要说明的是，本发明并不限于下述实施例，所给实施例是对本发明的进一步解释说明。实施例I :该实施例的底泥是扬州运河河流污染底泥,具体筛分方法为步骤一，从微污染水体中取底泥(半固体态)，将所取底泥在25°C下于液体培养基中培养驯化十五天，得到驯化后的活性底泥，其中底泥与液体培养基的体积比为1 10；培养驯化过程中每三天更换一次液体培养基，每次更换时所使用的液体培养基不同，所用的液体培养液按照更换次序依次为配水培养液、3体积的配水培养液与I体积的灭菌微污染水体组成的液体培养基、2体积的配水培养液与I体积的灭菌微污染水体组成的液体培养基、I体积的配水培养液与I体积的灭菌微污染水体组成的液体培养基、灭菌微污染水体；所述的配水培养液的配方为乙酸钠0.5g,NH4Cl 0. lg,KH2PO4 0. lg,MgSO4 · 7H20 :0. 05g,CaCl2 0. 05g,微量元素溶液2ml,蒸馏水IOOOmL;驯化的目的一是使生物菌群逐渐适应贫营养环境，二是逐渐达到富集应用于微污染水体的异养硝化细菌的目的，采用上述方法驯化15d后可完成底泥驯化，此时底泥由驯化初始的深黑色、散状转变为驯化末期的浅灰色、絮状，呈好氧污泥状态，停止曝气后取培养液，利用纳氏试剂比色法测定氨氮的去除率，经过15d的连续培养，底泥中生物菌群的氨氮的去除率可达70%以上，COD降解率可达到60%以上，采取驯化底泥的方法富集异养硝化菌群，逐渐降低营养液浓度达到所要筛选菌株的环境条件，给生物菌群有一个适应的过程，最终使异养硝化菌成为优势菌群；步骤二，以SYL固体培养基作为分离、纯化培养基，依次采用平板稀释法与平板划线法对驯化后的活性底泥内的生物菌群进行分离纯化，具体将6支IOml试管、6个培养皿及配制好的IL异养硝化细菌分离培养基在手提式压力蒸汽消毒器中进行灭菌备用；取生物摇床上的活性底泥，进行倍比稀释将其稀释成10' 10_2、10' 10_4、10_5、 ο-6六个梯度，以得到更多的单一菌落；选用混均法，分别从各个梯度稀释液中取Iml注入培养皿并进行编号，待培养基冷却到50°C左右，在每个培养皿中倒入约15ml相应的分离培养基，混匀后静置冷却，待其凝固后放入15°C电热恒温培养箱；在培养皿中的细菌长出后，根据各个菌落形态的特征，找出不同的菌落，采用平板划线法对分离出的各菌落进行纯化配制纯化异养硝化培养基(同分离培养基)并制成平板；用接种环挑取单菌落，接种到平板培养基上，并进行编号，放入15°C电热恒温培养箱，之后得到21株纯化细菌；所述的SYL固体培养基的配方为乙酸钠0.5g， NH4Cl 0. lg,KH2PO4 0. lg,MgSO4 · 7H20 :0. 05g,CaCl2 0. 05g,琼脂18g，蒸馏水IOOOmL;步骤三，对分离纯化得到的各细菌分别进行初筛，初筛方法为将待初筛的细菌的纯菌斜面，用灭菌后的SYK培养液洗到装有IOOmL的SYK培养液的三角瓶中，并在三角瓶内加入灭过菌的玻璃珠，用9层纱布包好瓶口，放入空气振荡器，在温度为25°C、转速为120rpm的条件下培养4d，同时在培养过程中，每日采用纳氏试剂比色法对培养中的细菌的氨氮去除率进行检测，其中氨氮去除率达70%以上的细菌为初筛得到的异养硝化细菌，该实施例得到2株对氨氮去除率达70%以上的异养硝化细菌菌株，所述SYK培养液的配方为乙酸钠0.05g，NH4Cl 0. Olg,KH2PO4 0. Olg,MgSO4 · 7H20 0. Olg,CaCl2 0. Olg,蒸馏水IOOOmL;由表I可以看出，这21株菌对水中的氨氮都有不同程度的去除，其中11和16号菌株对水中氨氮的去除率最高，对氨氮的去除率在70%以上，将其编号YZXll和YZX16，作为筛选出的一株应用于微污染水体的异养硝化细菌，保存备用。表I
权利要求
1.一种应用于治理微污染水体的异养硝化菌的筛选方法，其特征在于，该方法按下述步骤进行 步骤一，从微污染水体中取底泥，将所取底泥在25°c下于液体培养基中培养驯化十五天，得到驯化后的活性底泥，其中底泥与液体培养基的体积比为1 (10 20); 培养驯化过程中每三天更换一次液体培养基，每次更换时所使用的液体培养基不同，所用的液体培养液按照更换次序依次为配水培养液、3体积的配水培养液与I体积的灭菌微污染水体组成的液体培养基、2体积的配水培养液与I体积的灭菌微污染水体组成的液体培养基、I体积的配水培养液与I体积的灭菌微污染水体组成的液体培养基、灭菌微污染水体； 所述的配水培养液的配方为 乙酸钠0. 5g, NH4Cl 0. Ig, KH2PO4 0. Ig,MgSO4 · 7H20 0. 05g,CaCl2 0. 05g， 微量元素溶液2ml, 蒸懼水IOOOmL ； 步骤二，以SYL固体培养基作为分离纯化培养基，依次采用平板稀释法与平板划线法对驯化后的活性底泥内的生物菌群进行分离纯化，得到纯化细菌； 所述的SYL固体培养基的配方为 乙酸钠0. 5g, NH4Cl 0. Ig, KH2PO4 0. Ig,MgSO4 · 7H20 0. 05g,CaCl2 0. 05g, 琼脂18g， 蒸懼水IOOOmL ； 步骤三，对分离纯化得到的各细菌分别进行初筛，初筛方法为将待初筛的细菌菌落接种于SYK培养液中后在25 °C、120rpm的条件下于空气振荡器中培养4d,同时在培养过程中，采用纳氏试剂比色法对培养中的细菌的氨氮去除率进行检测，其中氨氮去除率达70%以上的细菌菌株为初筛得到的异养硝化细菌， 所述SYK培养液的配方为 乙酸钠0. 05g,NH4Cl 0. Olg, KH2PO4 0. Olg,MgSO4 · 7H20 0. Olg,CaCl2 0. Olg, 蒸懼水IOOOmL ； 步骤四，对初筛得到的异养硝化细菌分别进行复筛，复筛方法为将待复筛的异养硝化细菌接种于复筛培养液中后在25°C、120rpm的条件下于空气振荡器中培养48小时，同时在培养过程中，采用纳氏试剂比色法对培养中的异养硝化细菌的氨氮去除率进行检测，其中氨氮去除率达80%以上的异养硝化细菌为应用于治理微污染水体的异养硝化细菌， 所述复筛培养液的配方为 微量元素溶液2mL, 灭菌微污染水1000mL ； 所述微量元素溶液为以质量浓度计，I. Og/L EDTA、0. 2g/L ZnSO4,0. lg/LMnCl2 · 4Η20、0· 5g/L FeSO4 · 7Η20、0· 5g/L CuSO4 · 5Η20、0· 2g/L CoCl2 · 6H20 的水溶液。
全文摘要
本发明公开了一种应用于治理微污染水体的异养硝化菌的筛选方法。方法采取逐步驯化底泥的方法富集应用于微污染水体的异养硝化细菌群，即逐步减低营养物浓度的方式使异养硝化菌成为优势菌群，从而达到富集驯化的目的；接着采用“SYL固体培养基”对驯化后得到的活性污泥内的生物菌群采用平板稀释法与平板划线法分离和纯化；然后采用“SYK液体培养基”对分离、纯化后得到的纯菌进行初筛，得到对氨氮去除率达70％以上的菌株；最后采用灭菌的微污染水体添加微量元素溶液作为处理对象对初筛后的菌株进行复筛，得到应用于微污染水体的异养硝化菌，以有效解决微污染水体的水质恶化问题。
文档编号C02F3/34GK102851227SQ20121011281
公开日2013年1月2日 申请日期2012年4月17日 优先权日2012年4月17日
发明者苏俊峰, 黄廷林, 徐金兰, 朱维晃, 胡蕊, 魏巍, 黄文斌 申请人:西安建筑科技大学