专利名称：高密度介质固相抗人球蛋白试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域。
背景技术：
随着诊断技术的发展，抗人球蛋白实验在血小板，白细胞等血液 细胞抗原抗体的检测及细菌，病毒等病原微生物和可溶性蛋白抗原抗 体的检测中也得到广泛应用。不规则抗体指不符合ABO血型系统Landsteiner法则的血型抗 体，即抗A抗B以外的血型抗体， 一般因为输血、妊娠等发生同种免 疫而产生，多属于IgG类抗体。它是一种7S球蛋白，分子量小，分 子长度只250A"，与红细胞相应抗原结合后，在盐水介质中只能与红细 胞结合而不出现肉眼可见的凝集反应，必须通过特殊的方法如抗人球 蛋白法、聚凝胺法、酶法，才能使致敏细胞发生凝集反应，从而检出 此类抗体。如果受血者体内存在有临床意义的抗体，就会破坏输入的含有相 应抗原的红细胞，发生溶血性输血反应，影响红细胞输注的疗效，重 者危及患者生命。孕妇体内如含有不规则抗体，则会引起新生儿溶血 病，产生核黄疸等其他严重影响新生儿发育的综合症，给家庭和社会 带来沉重的负担，甚至引起新生儿死亡。因此，开展不规则抗体筛査是十分必要的。欧美等许多发达国家己将不规则抗体筛查作为常规检测，在我 国，卫生行政部门还没有相关的要求。临床上，医院及血站仅是对少 数患者进行抗体筛检。对献血者的抗体筛检更是空白，存在极大的安 全隐患。血小板抗体是由异体或自身血小板抗原作用机体而产生的，包括 同种异体抗体、自身抗体、同种抗体和药物依赖抗体四类，这些抗体 作用于人体血小板可引起新生儿同种异体免疫血小板减少症(NAIT)、血小板输注无效症(PTR)、输血后紫癜(PTP)等多种血小板免疫疾 病。同检测红细胞抗体的血清学方法相比，临床检测血小板抗体的实 验方法出现较晚。1987年Kiefel发明了单克隆抗体固着血小板抗原 分析(MAIPA)法，凭借其高灵敏度和特异性成为检测血小板抗体的"金 标准"。但该试验耗时长；技术要求高；如果待检血清中抗血小板抗 体与鼠单克隆抗体识别同一抗原决定簇则出现假阴性反应，这些缺点 也限制了它的广泛应用。近二十年，尽管出现了很多新方法如单克隆抗体固相血小板抗体试验(MASPAT)、抗原捕获试验(ACE)、修饰 的抗原捕获试验(MACE)和微柱凝胶免疫分析技术(MGIA)等，然而 各自都有其缺陷和不足，在临床应用中尚缺乏一种灵敏度高、特异性 好的简便方法。根据检测手段的不同，目前应用的血小板抗体检测方法大致分为 三类荧光标记二抗检测，酶标二抗检测，凝集试验，其原理都基于抗人球蛋白实验。
欧美等发达国家早在七十年代就将风疹、弓形虫、巨细胞病毒等 检测列为孕期筛查项目。
我国根据《中国妇女发展纲要(2001-2010)》和《中国儿童发展 纲要(2001-2010)》的要求，国家卫生部于2002年7月出台了《中 国提高出生人口素质、减少出生缺陷和残疾行动计划(2002-2010)》， 其中也明确提出加强产前筛査及诊断。
目前我国在孕前和孕早期进行TORCH检测，即对弓形虫、风疹病 毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒进行检测。
现有的TORCH检测方法有酶免疫斑点法、多重微珠免疫法、 ELISA法、金标法、PCR法、化学发光法。
现在血型血清学上广泛应用的抗人球蛋白试验为试管法。此方法 属于血凝试验，包括三个步骤
1、 致敏抗体与检测细胞一起孵育，抗体Fab段与检测细胞上 的相应表位发生免疫反应，抗体结合检测细胞，但不出现凝集。
2、 洗漆以除去反应体系中的未结合抗体。 一般采用离心法。
如果洗涤不彻底，残留的游离抗体会消耗后一步加入的抗人球蛋白， 减弱检出效果。
3、 加入抗人球蛋白试剂，离心。观察凝集强度。 现有抗人球蛋白试验方法存在下列不足
1、使用新鲜红细胞，而新鲜红细胞的最大缺点是保存期短，常 常因为产品过期造成浪费。2、 操作过程繁琐，每次只能检测少量的标本，很难开展大量样 本的检测。
3、 技术要求高， 一般由实验室高年资技术人员操作或示范，技 术普及难度大。
4、 结果判读存在主观性，不同操作人员可能会判读出不同的结
果，难以标准化。
5、 观察结果时间短，实验结果无法保存， 一旦出现医疗纠纷难
以判定责任。
6、 实验过程为手工操作，难以自动化。
发明内容
本发明的目的是提供一种高通量、检测试剂保存期长，可用于红 细胞、血小板、白细胞等血液细胞抗原抗体的检测以及细菌，病毒等 病原微生物和可溶性蛋白抗原抗体的检测的高密度介质固相抗人球 蛋白试剂盒。
本发明的试剂盒包括
a、 U型反应板其上已包被抗人球蛋白；
b、 隔离液将抗原抗体反应体系与包被在U型反应板上的抗人 球蛋白隔离开，并且在磁化过程中，将游离抗体阻隔；
c、 增强介质增强抗原抗体反应；
d、 检测试剂新鲜红细胞或细胞膜磁化细胞或瞬间磁化红细胞 或动物细胞或人工合成的免疫微颗粒；
e、 阴性对照血清，与上述筛检细胞无凝集反应的人血清；f、阳性对照血清，与上述筛检细胞有凝集反应的人血清。
本发明包被抗人球蛋白U型反应板的制备用pH9.6， 0.05M碳 酸盐缓冲液将抗人球蛋白配制成10ug/ml浓度，按100ul/孔加入孔中， 置4。C冰箱中包被过夜，次日取出，用含有0.05%吐温的pH7.2， 0.01M 磷酸盐缓冲液洗涤4次，扣干，置-2(TC备用。
本发明所述的抗人球蛋白包被浓度是lug/孔。
本发明隔离液的制备用pH7.2， 0.01M磷酸盐缓冲液配制25。/。 蔗糖与10%泛影葡胺，两者等体积混合。
本发明增强介质的制备用pH7.2， O.OIM磷酸盐缓冲液配制1% 牛血清白蛋白。
本发明红细胞瞬间磁化试剂的制备将FeCl3和FeCb按摩尔比 溶解于45ml0.17M HCL溶液中，过滤，室温条件下，将其逐滴加入 搅拌均匀且通入氮气的75mll M NaOH溶液，剧烈搅拌反应，制得 磁性粒子，用蒸馏水将其洗涤至中性；瞬间磁化红细胞的制备将新 鲜红细胞用生理盐水洗涤后，取压积红细胞用磁化试剂配成1%的细 胞悬液，37t:孵育5min。
本发明的检测方法是在包被有抗人球蛋白的U型反应板中加入 隔离液与增强介质，然后加入待检血浆或血清，再加入筛检细胞，37 。C孵育30分钟，然后离心或磁力吸附观察结果，筛检细胞平铺在反 应板的底部为阳性，聚集在反应孔的底部形成一个小点为阴性。介于 二者之间的为弱阳性。
本发明用于红细胞、血小板、白细胞血液细胞抗原抗体的检测及细菌、病毒病原微生物和可溶性蛋白抗原抗体的检测。
本发明的优点试剂盒保存期长，检测方法简便、易行，不用洗
涤、离心，结果易于判定，可同时对大量样本进行检测，易于自动化。
具体实施例方式
本发明的试剂盒包括
a、 U型反应板其上已包被抗人球蛋白；
b、 隔离液将抗原抗体反应体系与包被在U型反应板上的抗人 球蛋白隔离开，并且在磁化过程中，将游离抗体阻隔；
C、增强介质增强抗原抗体反应；
d、 检测试剂新鲜红细胞或细胞膜磁化细胞或瞬间磁化红细胞 或动物细胞或人工合成的免疫微颗粒；
e、 阴性对照血清，与上述筛检细胞无凝集反应的人血清；
f、 阳性对照血清，与上述筛检细胞有凝集反应的人血清。 本发明包被抗人球蛋白U型反应板的制备用pH9.6， 0.05M碳
酸盐缓冲液将纯化的抗人球蛋白配制成10ug/ml浓度，按100ul/孔加 入孔中，置4'C冰箱中包被过夜，次日取出，用含有0.05%吐温的 pH7.2， 0.01M磷酸盐缓冲液洗涤4次，扣干，置-20。C备用。
本发明所述的抗人球蛋白包被浓度是lug/孔。
本发明隔离液的制备用pH7.2， 0.01M磷酸盐缓冲液配制250/。 蔗糖与10%泛影葡胺，两者等体积混合，按终浓度0.1。/o加入NaN3。
本发明增强介质的制备用pH7.2， O.OIM磷酸盐缓冲液配制1% 牛血清白蛋白，按终浓度0.1。/。加入NaN3。本发明红细胞瞬间磁化试剂的制备将FeCl3和FeCl2按摩尔比 溶解于45ml0.17M HCL溶液中，过滤，室温条件下，将其逐滴加入 搅拌均匀且通入氮气的75mll M NaOH溶液，剧烈搅拌反应，制得 磁性粒子，用蒸馏水将其洗涤至中性，用pH7.2， O.OIM磷酸盐缓冲 液将其配成0.5%浓度。
瞬间磁化红细胞的制备将新鲜红细胞用生理盐水洗涤后，取压 积红细胞用磁化试剂配成1%的细胞悬液，37。C孵育5min。
本发明细胞膜磁化细胞的制备(此技术已申请专利，专利号
200510017117.1)
利用磁性粒子将新鲜红细胞制备成细胞膜磁化细胞。
具体过程是
1、 红细胞抗原的制备
① 取新鲜红细胞，离心去上清。取压积红细胞进入下一步处理；
② 在压积红细胞中加入十二烷基硫酸钠置于室温状态；
③ 然后进行离心去上清，留沉淀物加入蒸馏水；
2、 磁性粒子的制备
① 金属盐的溶解，将FeCL2及FeCL3加入蒸馏水中进行溶解；
② 金属盐的水解，在剧烈搅拌的状态下，将氢氧化钠加入到金属 盐溶液中，使其水解为金属复合氧化物，也就是铁颗粒溶液；
3、 细胞膜抗原包被磁性粒子
将步骤一获得的红细胞膜抗原加入到步骤二获得的铁颗粒溶液 中，再加入聚乙二醇，进行孵育，离心后弃上清，留沉淀，再在沉淀物中加入低渗磷酸盐缓冲液，即得包被了磁性粒子的细胞膜抗原。
动物细胞或人工合成的免疫微颗粒。通过戊二醛或碳二亚胺活化 动物细胞或人工合成的免疫微颗粒，使其具有化学基团，进而与生物 分子(抗原或抗体)发生偶联。
阴性对照血清经国家规定的五项指标(转氨酶、乙肝、丙肝、 梅毒、艾滋病)检测合格的健康成年人，且与上述检测细胞(试剂) 不发生反应的人血清，表明其血清中不含有检测细胞(试剂)上抗原 (抗体)相对应抗体(抗原)。
阳性对照血清经国家规定的五项指标(转氨酶、乙肝、丙肝、 梅毒、艾滋病)检测合格的健康成年人，且与上述检测细胞(试剂) 发生反应的人血清，表明其血清中含有检测细胞(试剂)上抗原(抗 体)相对应抗体(抗原)。
本发明用于红细胞、血小板、白细胞血液细胞抗原抗体的检测及 细菌、病毒病原微生物和可溶性蛋白抗原抗体的检测。
本发明的原理首先采用高密度的液体隔离了血清与包被在反应 板上的抗人球蛋白，保证了抗人球蛋白的数量。在磁场或离心力作用 下，使抗原抗体与游离的血清分离，而省去了洗涤的步骤。其次不仅 可应用新鲜细胞，而且可应用细胞膜磁化细胞，红细胞瞬间磁化液及 动物细胞或人工合成的免疫微颗粒作为检测试剂，检测试剂保存期 长。采用固相凝集的方法进行红细胞、血小板、白细胞等血液细胞抗 原抗体的检测以及细菌，病毒等病原微生物和可溶性蛋白抗原抗体的待检血清与检测细胞在孵育过程中，通过隔离液将血清与包被板 上的抗人球蛋白隔离，反应结束后，通过磁力或离心力作用将形成的 抗原抗体复合物与游离血清分离，可检测待检血清中是否含有不规则 抗体及进行交叉配血或其他病原微生物的检测。
检测过程是
在包被有抗人球蛋白的U型反应板中加入隔离液与增强介质， 然后加入待检血浆或血清，再加入筛检细胞(可以是新鲜细胞或瞬间 磁化细胞或红细胞膜抗原磁珠或者包被有病原微生物抗原(如丙肝 抗原、梅毒抗原、乙肝抗原、艾滋病抗原、EB病毒抗原)的动物细
胞或磁性微粒)，37t:孵育30分钟，然后离心或磁力吸附观察结果，
筛检细胞平铺在反应板的底部为阳性，聚集在反应孔的底部形成一个 小点为阴性。介于二者之间的为弱阳性。 实施例1 红细胞不规则抗体检测
在包被有抗人球蛋白的u型反应板中加入隔离液与增强介质，
然后加入待检血浆或血清，再加入筛检细胞(可以是新鲜细胞或瞬间
磁化细胞或红细胞膜抗原磁珠)，37T:孵育30分钟，然后离心或磁力 吸附观察结果，筛检细胞平铺在反应板的底部为阳性，聚集在反应孔 的底部形成一个小点为阴性。介于二者之间的为弱阳性。 实施例2血小板抗体检测
在包被有抗人球蛋白的U型反应板中加入隔离液与增强介质， 然后加入血小板与待检血浆或血清，再加入指示颗粒，即包被有血小 板抗体的动物细胞或磁性微粒，37"C孵育30分钟，然后离心或磁力吸附观察结果，指示颗粒平铺在反应板的底部为阳性，聚集在反应孔 的底部形成一个小点为阴性。介于二者之间的为弱阳性。
实施例3病原微生物抗体检测
在包被有抗人球蛋白的U型反应板中加入隔离液与增强介质， 然后加入待检血浆或血清，再加入指示颗粒，即包被有病原微生物抗
原(如丙肝抗原、梅毒抗原、乙肝抗原、艾滋病抗原、EB病毒抗
原)的动物细胞或磁性微粒，37t:孵育30分钟，然后离心或磁力吸 附观察结果，指示颗粒平铺在反应孔的底部为阳性，聚集在反应孔的 底部形成一个小点为阴性。介于二者之间的为弱阳性。
权利要求
1、一种高密度介质固相抗人球蛋白试剂盒，其特征在于a、U型反应板其上已包被抗人球蛋白；b、隔离液将抗原抗体反应体系与包被在U型反应板上的抗人球蛋白隔离开，并且在磁化过程中，将游离抗体阻隔；c、增强介质增强抗原抗体反应；d、检测试剂新鲜红细胞或细胞膜磁化细胞或瞬间磁化红细胞或动物细胞或人工合成的免疫微颗粒；e、阴性对照血清，与上述筛检细胞无凝集反应的人血清；f、阳性对照血清，与上述筛检细胞有凝集反应的人血清。
2、 根据权利要求1所述的高密度介质固相抗人球蛋白试剂盒，其特征在于包被抗人球蛋白U型反应板的制备用pH9.6， 0.05M 碳酸盐缓冲液将抗人球蛋白配制成10ug/ml浓度，按100ul/孔加入孔 中，置4。C冰箱中包被过夜，次日取出，用含有0.05。/。吐温的pH7.2， 0.01M磷酸盐缓冲液洗涤4次，扣干，置-2(TC备用。
3、 根据权利要求1或2所述的高密度介质固相抗人球蛋白试剂 盒，其特征在于所述的抗人球蛋白包被浓度是lug/孔。
4、 根据权利要求1所述的高密度介质固相抗人球蛋白试剂盒， 其特征在于隔离液的制备用pH7.2， O.OIM磷酸盐缓冲液配制25% 蔗糖与10%泛影葡胺，两者等体积混合。
5、 根据权利要求1所述的高密度介质固相抗人球蛋白试剂盒， 其特征在于增强介质的制备用pH7.2， O.OIM磷酸盐缓冲液配制1%牛血清白蛋白。
6、 根据权利要求1所述的高密度介质固相抗人球蛋白试剂盒， 其特征在于红细胞瞬间磁化试剂的制备将FeCl3和FeCl2按摩尔比溶解于 45ml0.17M HCL溶液中，过滤，室温条件下，将其逐滴加入搅拌均 匀且通入氮气的75mll M NaOH溶液，剧烈搅拌反应，制得磁性粒 子，用蒸馏水将其洗涤至中性；瞬间磁化红细胞的制备将新鲜红细胞用生理盐水洗涤后，取压 积红细胞用磁化试剂配成1%的细胞悬液，37。C孵育5min。
7、 权利要求高密度介质固相抗人球蛋白试剂盒的检测方法，其 特征在于在包被有抗人球蛋白的U型反应板中加入隔离液与增强 介质，然后加入待检血桨或血清，再加入筛检细胞，37。C孵育30分 钟，然后离心或磁力吸附观察结果，筛检细胞平铺在反应板的底部为 阳性，聚集在反应孔的底部形成一个小点为阴性。介于二者之间的为 弱阳性。
8、 权利要求1所述的高密度介质固相抗人球蛋白试剂盒用于红 细胞、血小板、白细胞血液细胞抗原抗体的检测及细菌、病毒病原微 生物和可溶性蛋白抗原抗体的检测。
全文摘要
一种高密度介质固相抗人球蛋白试剂盒，属于生物技术领域。本发明的目的是提供一种高通量、检测试剂保存期长，可用于红细胞、血小板、白细胞等血液细胞抗原抗体的检测以及细菌，病毒等病原微生物和可溶性蛋白抗原抗体的检测的高密度介质固相抗人球蛋白试剂盒。本发明的试剂盒包括U型反应板、隔离液、增强介质、检测试剂、阴性对照血清、阳性对照血清。本发明的优点试剂盒保存期长，检测方法简便、易行，不用洗涤、离心，结果易于判定，可同时对大量样本进行检测，易于自动化。
文档编号G01N33/80GK101315386SQ20081005095
公开日2008年12月3日 申请日期2008年7月11日 优先权日2008年7月11日
发明者井伟东, 刘永茂, 孔维臣, 孙育昌, 冬 李, 勇 李, 杨文冲, 段生宝, 军 童, 赵子臣, 墅 邹, 马学严 申请人:勇 李