专利名称：一种使用gapdh基因分析arhgdib基因表达量的rt-pcr技术的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种使用GAPDH基因mRNA为内参，对ARHGDIB基因进行相对定量的实 时荧光RT-PCR扩增检测技术，并形成相应试剂盒，属于分子生物技术领域。
背景技术：
随着人类基因组图谱的完成，人们开始进入后基因组时代，重点也转向了研究各 基因在生命中的作用，包括基因在生长发育、遗传、疾病、外型体征等方面的作用。其中，对 于RhoGDP dissociation inhibitor (GDI) beta基因(ARHGDIB基因)表达的研究也越来越 多。 基因表达的检测有几种方法。经典的方法是根据在细胞或生物体中所观察到的生 物化学或表型的变化来决定某一特定基因是否表达。随着大分子分离技术的进步使得特异 的基因产物或蛋白分子的识别和分离成为可能。随着重组DNA技术的运用，现在有可能检 测、分析任何基因的转录产物。目前有好几种方法广泛应用于研究特定RNA分子。这些方 法包括RT-PCR、原位杂交、NORTHERN凝胶分析、打点或印迹打点、S-1核酸酶分析、RNA酶保 护研究以及基因芯片等。 荧光探针PCR技术是今年兴起并得到快速发展的技术，是将同时带有关联的荧光 发光基团(能量供体)和淬灭基团(能量受体)的荧光探针结合PCR技术而产生的一种 新的检测技术，具有灵敏度高、特异性强，且不易发生产物污染等特点，包括Taqman探针技 术、分子信标(Beacan探针)等，由于该技术操作简便，检测速度快，且各方面性能都有优 势，目前在临床、研究等核酸检测领域得到广泛的应用。 GAPDH (Human glyceraldehyde_3-phosphate dehydrogenase)基因为常用的看家 基因，在人体细胞内表达情况较为稳定，已被广泛用于基因表达的研究，利用A ACt值的 方法能对其他基因的表达情况进行相对定量分析。公式为F = 2—AAet。
本发明将RT-PCR与荧光探针技术结合，通过广泛筛选和优化检测引物和探针，同 时对细胞内的GAPDH基因和ARHGDIB基因mRNA进行相对定量分析。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速、简便的使用GAPDH基因分析ARHGDIB基因表达量 的RT-PCR技术。 为解决上述问题，本发明提供了一种一步法RT-PCR同时检测GAPDH基因mRNA和 ARHGDIB基因mRNA的技术。 根据GeneBank序列号为NC_000012的基因序列为模板，设计了一对引物及特异性 探针，检测长度为139bp的目标mRNA，其引物探针序列分别为
引物1 :5—-ACCACAGAAGTCCCTGAAAGAGCT-3— (Seq No. 1)
引物2 :5— -GGTGAGCCGGGTGACAACGAC-3— (Seq No. 2)
4
探针1 :5—-TCGGATCTGTCACCACAGGACCA-3— (Seq No. 3)
或探针2 :5—-TGGTCCTGTGGTGACAGATCCGA-3— (Seq No. 4) 设计的探针跨越了 NCJ)00012基因序列中第111098-111743位核苷酸的内含子，
分别与其两端的外显子特异性匹配，这样可非常有效的避免基因组DNA对实验结果的影
响，同时也省去了使用DNA酶对样本进行消化用以去除DNA干扰的步骤。 根据GeneBank序列号为NW_925295的基因序列为模板，设计了一对引物及特异性
探针，检测长度为131bp的内参(GAPDH基因)mRNA，其引物探针序列分别为 引物3 :5—-TCAAGATCATCAGCAATGCCT-3— (Seq No. 5) 引物4 :5—-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3— (Seq No. 6)探针3 :5—-ACTGTGGTCATGAGTCCTTCCACGA-3— (Seq No. 7) 或者上述弓I物序列的互补序列，或者上述序列同源性大于75 %的序列。 计的探针跨越了 NW_925295基因序列中第2104-2193位核苷酸的内含子，分别与
其两端的外显子特异性匹配，这样可非常有效的避免基因组DNA对实验结果的影B向，同时
也省去了使用DNA酶对样本进行消化用以去除DNA干扰的步骤。 上述试剂盒的探针(探针1、探针2和探针3)，其5—端的荧光发光基团可为FAM、 TET、 J0E、 Cy3、 Cy5、 Cy5. 5、 Fluorescein、 Rhodamine、 Rhodamine Red、 Rhodamine Green、 Rhodamine6G、 Oregon Green 488、 Oregon Green 500、 Oregon Green 514、 Texas Red、 TAMRA、 Inosine、 HEX、 FITC、 Acridine orange或ROX中任意一种；3—端荧光淬灭基团可为 DABCYL、 DABSYL、 Eclipse、 TAMRA、 BHQ-l、 BHQ_2、 BHQ-3或MGB基团中的任意一种。
本发明提供的使用GAPDH基因mRNA分析ARHGDIB基因相对表达量的RT-PCR试剂 盒是使用一步法RT-PCR的技术，使操作更为简便、快速。使用表达量相对稳定的GAPDH基 因与目标基因同时检测，能对标本中的ARHGDIB基因mRNA进行相对表达量进行定量分析。
本发明提供的使用GAPDH基因分析ARHGDIB基因表达量的RT-PCR技术形成的试 剂盒，使用2个人工合成的RNA序列作为RNA阳性对照品，序列为
模板1 :7
(139bp)(Seq No. 8)
模板2
(Seq No.9) 其中，ARHGDIB基因mRNA检测体系使用模板1作为阳性对照品，GAPDH基因mRNA 检测体系使用模板2作为阳性对照品。 本发明提供的使用GAPDH基因分析ARHGDIB基因表达量的RT-PCR技术形成的试 剂盒组成为 组成成分(20人份/盒)体积
反应缓冲液A 380 ill 反应缓冲液B 380 ill 混合酶 60 ill RNA阳性对照品A 30
RNA阳性对照品B 30
DEPC水 1ml 其中，反应缓冲液的组分(终浓度)包括50mM Tris-HCl(PH 8. 3)、50mM KCl、 300uMdNTP、3mM MgCl2，而且ARHGDIB基因mRNA检测体系(反应缓冲液A)含200nM引物1、 200nM引物2和200nM探针l，GAPDH基因mRNA检测体系(反应缓冲液B)含200nM引物3、 200nM引物4和200nM探针3，其中，两条探针的5—端标记的发光基团均为FAM，在3—端标 记的淬灭基团均为Eclipse。混合酶的组成成份(终浓度)包括0. 5U AMV酶、0. 5U RNase Inhibitor、0. lmg/ml BSA、5mM DTT、1.5U Taq酶、0.05U UNG酶。
本发明提供的试剂盒操作步骤如下
PCR反应液的配制 A管按每人份反应缓冲液A 19ul、混合酶3ul的配方配制PCR反应液，并按22u1/ 管分装到0. 2ml PCR管中，然后加入适量待检的总RNA并补充DEPC水，使反应总体积为
30ul ; B管按每人份反应缓冲液B 19ul、混合酶3ul的配方配制PCR反应液，并按22u1/ 管分装到0. 2ml PCR管中，然后加入适量待检的总RNA并补充DEPC水，使反应总体积为
30ul ; RNA阳性对照品直接取8ul ， A管使用RNA阳性对照品A， B管使用RNA阳性对照品 B，按如下程序进行一步法RT-PCR检测反应管先在5(TC反应5分钟，然后95t:保温5分 钟，再按94°C 20秒一60°C 35秒循环40次(6(TC退火条件下采集荧光)。
采用比较Ct值的相对定量法，即通过标本的两管检测Ct值与正常对照品的两管 检测Ct值的A A Ct值，根据F = 2—A Aet公式计算ARHGDIB基因相对GAPDH基因的表达量。
传统的RT-PCR使用两步法扩增，时间长，操作相对复杂，且因多了一个步骤而易 发生污染，所以本发明提供的试剂盒采用一步法RT-PCR技术，将RT步骤与PCR步骤一步完 成，无须开管进行二次加样，将少了污染的机会。由于反应体系中RT步骤是使用特异性引 物进行延伸，与传统的随机引物法相比，逆转录需要的时间更短，通常可在1. 5小时内完成 全部RT-PCR反应，并且由于试剂盒使用热稳定性较强的AMV逆转录酶，可在5(TC进行RT反 应，产品的特异性非常高。
具体实施例方式
根据GeneBank中的人类基因组12号染色体ARHGDIB基因相关序列进行比对和分 析，设计和制备引物与探针(设计模板GeneBank序列号为NCJ)00012):
引物1 :5—-ACCACAGAAGTCCCTGAAAGAGCT-3— (Seq No. 1) 引物2 :5—-GGTGAGCCGGGTGACAACGAC-3— (Seq No. 2) 探针1 :5—-FAM-TCGGATCTGTCACCACAGGACCA-Eclipse-3— (Seq No. 3)
设计并制备人工合成RNA序列
(Seq No. 8) 根据GeneBank中的人类基因组12号染色体GAPDH基因相关序列进行比对和分
6析，设计和制备引物与探针(设计模板GeneBank序列号为NW—925295):
引物3 :5—-TCAAGATCATCAGCAATGCCT-3— (Seq No. 5) 引物4 :5—-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3— (Seq No. 6) 探针3 :5—-FAMACTGTGGTCATGAGTCCTTCCACGAEclipse-3— (Seq No. 7)
设计并制备人工合成RNA序列
No. 9) 将人工合成的两条RNA序列用DEPC处理过的水溶解并稀释至适当浓度，分别作为 ARHGDIB和GAPDH基因mRNA的阳性对照品。 按如下配方配制反应缓冲液A(终浓度)50mM Tris-HC1(PH 8. 3)、50mM KCl、 300uMdNTP、3mM MgCl2、200nM引物1、200nM弓|物2禾P 200nM探针1。 按如下配方配制反应缓冲液B(终浓度):50mM Tris-HC1(PH 8. 3)、50mM KCl、 300uMdNTP、3mM MgCl2、200nM引物3、200nM弓|物4禾P 200nM探针3。 按如下配方配制混合酶(终浓度):0.5U AMV酶、0.5U RNase Inhibitor、0. lmg/ ml BSA、5mM DTT、1.5U Taq酶、0.05U UNG酶。
试剂盒组成为
组成成分(20人份
反应缓冲液A 反应缓冲液B 混合酶
RNA阳性对照品A RNA阳性对照品B DEPC水
盒) 380 ii 1 380 ii 1 60 ii 1 30 ii 1 30 ii 1 lml
体积
本发明提供的试剂盒未提供mRNA提取试剂，用户可根据自身要求使用传统的 酚_氯仿提取方法或购买商业化的RNA提取试剂盒。
检测步骤
PCR反应液的配制 A管按每人份反应缓冲液A 19ul、混合酶3ul的配方配制PCR反应液，并按22ul/ 管分装到0. 2ml PCR管中，然后加入适量待检的总RNA并补充DEPC水，使反应总体积为
30ul ; B管按每人份反应缓冲液B 19ul、混合酶3ul的配方配制PCR反应液，并按22u1/ 管分装到0. 2ml PCR管中，然后加入适量待检的总RNA并补充DEPC水，使反应总体积为
30ul ; RNA阳性对照品直接取8ul ， A管使用RNA阳性对照品A， B管使用RNA阳性对照品 B，按如下程序进行一步法RT-PCR检测反应管先在5(TC反应5分钟，然后95t:保温5分 钟，再按94°C 20秒一60°C 35秒循环40次(6(TC退火条件下采集荧光)。
结果分析与监控 根据仪器分析的结果，在如下情况视实验有效对照品A和对照品B的Ct值均< 32且大于26。
根据公式F = 2—"n计算相对表达量。也有部分全自动荧光PCR扩增仪可直接读取△ ACt值。SEQUENCE LISTING〈110〉上海复星医药(集团)股份有限公司上海复星医学科技发展有限公司剑军，何懿，夏〈120> —种使用GAPDH基因分析ARHGDIB基因表达量的RT-PCR技术<160>9〈170>PatentIn version 3. 3〈210>1〈211>24〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>13ccac3g朋g tccctga肪g agct<210>2〈211>21〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>2ggtgagccgg gtgacaacga c〈210〉3〈211>23<212>DNA〈213〉人工序列〈400>3tcggatctgtcaccacagga cca〈210>4〈211>23〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>4tggtcctgtg gtgacagatc cga〈210>5〈211>21〈212>DNA〈213〉人工序列
〈400>5tcaagatcat cagcaatgcc t21〈210>6<211〉21〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>6agtcttctgg gtggcagtga t21〈210>7〈211>25〈212>廳〈213〉人工序列〈400>7actgtggtca tgagtccttc cacga25<210〉8〈211>139〈212>RNA〈213〉人工序列<400〉83ccac3gaag ucccug朋3g 3gcugcaggagaugaugagagucimauima60gimc朋g朋3 acgcugcugg gag肌gguccUgUggUg3C3g肌CCg朋3gccccc朋ugu120Cg皿gUC3CC CggCUC3CC139〈210>9〈211>131〈212>RNA〈213>人工序列〈400>9uc朋g肌c;au cagc朋ugcc uccugcaccscc朋cugc皿agcaccccuggcc朋gguca60ucc肌g3csm c皿uggimuc gugg朋gg3cUC3Ug3CC3Cagucc肌gccSlUC3CUgCC3120cccag朋gac u131
9
权利要求
一种使用GAPDH基因分析ARHGDIB基因表达量的RT-PCR技术，其特征在于包含用于检测ARHGDIB基因mRNA的一对特异性引物和一条特异性探针以及用于检测GAPDH基因mRNA的一对特异性引物和一条特异性探针，扩增目标片段长度分别为139bp和131bp，引物和探针序列分别为检测ARHGDIB基因mRNA的引物和探针引物15`-ACCACAGAAGTCCCTGAAAGAGCT-3`(Seq No.1)引物25`-GGTGAGCCGGGTGACAACGAC-3`(Seq No.2)探针15`-TCGGATCTGTCACCACAGGACCA-3`(Seq No.3)或探针25`-TGGTCCTGTGGTGACAGATCCGA-3`(Seq No.4)检测GAPDH基因mRNA的引物和探针引物35`-TCAAGATCATCAGCAATGCCT-3`(Seq No.5)引物45`-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3`(Seq No.6)探针35`-ACTGTGGTCATGAGTCCTTCCACGA-3`(Seq No.7)或者上述引物序列的互补序列，或者上述序列同源性大于75％的序列。
2. 根据权利要求1所述的一种使用GAPDH基因分析ARHGDIB基因表达量的RT-PCR技术，其特征在于标记探针5—端的荧光发光基团可为FAM、 TET、 J0E、 Cy3、 Cy5、 Cy5. 5、Fluorescein、 Rhodamine、 Rhodamine Red、 Rhodamine Green、 Rhodamine 6G、 OregonGreen488、Oregon Green 500、Oregon Green 514、Texas Red、TAMRA、Inosine、HEX、FITC、Acridine orange或R0X中任意一种；3—端荧光淬灭基团可为DABCYL、 DABSYL、 Eclipse、TAMRA、 BHQ-1 、 BHQ_2、 BHQ-3或MGB基团中的任意一种。
3. 根据权利要求1所述的一种使用GAPDH基因分析ARHGDIB基因表达量的RT-PCR技术，其特征在于使用一步法RT-PCR荧光检测技术，对待测标本和正常对照品中的ARHGDIB基因mRNA和GAPDH基因mRNA同时进行检测，对ARHGDIB基因的表达量进行相对定量分析。
4. 根据权利要求1所述的一种使用GAPDH基因分析ARHGDIB基因表达量的RT-PCR技术，其特征在于，可形成试剂盒，使用2个人工合成的RNA序列作为RNA阳性对照品，序列为模板1bp)(Seq No. 8)模板2 :No. 9)。
5. 根据权利要求4所述的使用GAPDH基因分析ARHGDIB基因表达量的RT-PCR技术形成的试剂盒，其特征在于，ARHGDIB基因mRNA检测体系使用模板1作为阳性对照品，GAPDH基因mRNA检测体系使用模板2作为阳性对照品。
6. 根据权利要求4所述的一种使用GAPDH基因分析ARHGDIB基因表达量的RT-PCR技术形成的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒组成为组成成分(20人份/盒) 体积反应缓冲液A 380 ill反应缓冲液B 380 ill混合酶 60 ii 1RNA阳性对照品A 30 illRNA阳性对照品B 30 illDEPC水 1ml其中，反应缓冲液的组分(终浓度)包括50mM Tris-HCl (Ph 8. 3) 、50mM KCl、300uMdNTP、3mM MgCl2，而且ARHGDIB基因mRNA检测体系(反应缓冲液A)含200nM引物1、200nM弓|物2禾P 200nM探针1， GAPDH基因mRNA检测体系(反应缓冲液B)含200nM引物3、200nM引物4和200nM探针3，其中，两条探针的5—端标记的发光基团均为FAM，在3—端标记的淬灭基团均为Eclipse。混合酶的组成成份(终浓度)包括0. 5U AMV酶、0. 5URNaselnhibitor、0. lmg/ml BSA、5mM DTT、1.5U Taq酶、0. 05U UNG酶。RNA阳性对照品A和RNA阳性对照品B分别为适当浓度的模板1和模板2。
7.根据权利要求6所述的一种使用GAPDH基因分析ARHGDIB基因表达量的RT-PCR技术形成的试剂盒，其特征在于，操作步骤如下PCR反应液的配制A管按每人份反应缓冲液A 19ul、混合酶3ul的配方配制PCR反应液，并按22ul/管分装到O. 2ml PCR管中，然后加入适量待检的总RNA并补充DEPC水，使反应总体积为30ul ;B管按每人份反应缓冲液B 19ul、混合酶3ul的配方配制PCR反应液，并按22ul/管分装到O. 2ml PCR管中，然后加入适量待检的总RNA并补充DEPC水，使反应总体积为30ul ;RNA阳性对照品直接取8ul，A管使用RNA阳性对照品A，B管使用RNA阳性对照品B，按如下程序进行一步法RT-PCR检测反应管先在5(TC反应5分钟，然后95"C保温5分钟，再按94°C 20秒一60°C 35秒循环40次(6(TC退火条件下采集FAM通道荧光)。结果分析，根据标本的两管检测Ct值与正常对照品的两管检测Ct值的A ACt值，对ARHGDIB进行相对定量分析。
全文摘要
本发明涉及一种使用GAPDH基因分析ARHGDIB基因表达量的RT-PCR技术。本发明分别根据人的ARHGDIB基因mRNA和GAPDH基因mRNA设计并筛选到最佳PCR检测方案，能同时对标本中的两个基因的mRNA进行检测，根据两个基因的mRNA检测Ct值与正常对照两个基因的mRNA检测Ct值的ΔΔCt值，可分析ARHGDIB基因与看家基因-GAPDH基因之间的相对表达量。同时本发明提供相应的一步RT-PCR检测试剂盒。本发明还提供人工合成的两种RNA，减少假阴性的发生率；本发明检测速度快，能排除基因组DNA的干扰，特异性强，且灵敏度高，可用于ARHGDIB基因表达方面的研究和临床。
文档编号G01N21/64GK101760522SQ20081020164
公开日2010年6月30日 申请日期2008年10月23日 优先权日2008年10月23日
发明者何剑军, 夏懿 申请人:上海复星医药(集团)股份有限公司;上海复星医学科技发展有限公司