专利名称：用于固相萃取的活性聚合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于固相萃取(SPE)的活性聚合物以及使用形成荧光异吲哚络合物的方法测定分析物。
背景技术：
诸多种类的人类食品和动物饲料，包括食用坚果、油籽、谷物、饲料以及由此派生出来的产品容易受到霉菌毒素的污染。霉菌毒素是有毒的真菌代谢副产物，其对食品和饲料谷物的污染可以发生在收获之前和/或之后。霉菌毒素污染物中，最主要的是黄曲霉素和赭曲毒素。霉菌毒素污染程度的直接测定是食品和饲料质量控制中的一个重要方面。通常使用高效液相色谱(HPLC)进行这项检测。但是，在没有高效液相色谱仪器或 者其不适用的情况下，也可以使用薄层色谱(TLC)进行检测。商业扫描仪可用于经薄层色谱分离后的样品中的霉菌毒素的测定。此扫描仪使用发射波长为366nm的汞灯作为光源来激发荧光。随后通过光电倍增管检测和定量荧光。在一些薄层色谱基质中，吸附层含有无机磷光或者有机荧光指示剂。在这些体系中，分析物的检测是基于样品成分对磷光或荧光的烊灭。能够烊灭背景荧光的分析物包括含芳香基团(例如大环内酯物)的化学试剂，比如抗生素以及其他天然产物。食品样品萃取得到的溶液在进行定量检测之前，可能需要经过“清除”程序。“清除”程序通常包括使用固相萃取除去可能会干扰霉菌毒素测试的化合物。使用小色谱柱(所谓的“微柱”)可以进行霉菌毒素的定量检测。在微柱内，霉菌毒素由于在矿物吸附质中形成一层而被固定下来。在紫外光下观察微柱，紫外光可引起被固定的霉菌毒素发出荧光。多种微柱检测方法已被国际公职分析化学家协会(AOAC)采纳为正式的霉菌毒素检测方法。关于霉菌毒素的定量分析，WO 2006/123189描述了用于评估固定在微柱各层中的霉菌毒素样品的荧光检测仪。此仪器还可以用于评估固定在分子印记聚合物以及作为固相萃取柱中吸附剂的非分子印记(空白)聚合物中的霉菌毒素。具有固相萃取柱和荧光检测仪的系统可以用于检测霉菌毒素外的其他分析物。其在食品领域内的其他应用包括对农药和兽药残留量、藻毒素、违禁染料(例如苏丹红I)以及食品质量指标的检测。除食品领域以外，柱子和仪器的潜在应用领域还包括对环境污染物、滥用药物以及假冒药物的控制。此外，在司法和卫生部门也有所应用。在传统的固相萃取柱中，使用分子印记或空白聚合物吸附剂选择性吸附分析物。通过检测被束缚的化合物的荧光探测此种结合。本发明基于一种活性聚合物的使用，通过荧光异吲哚络合物的形成检测其与分析物间的结合。发明概述一个方面，本发明提供了一个作为固相萃取吸附剂的活性聚合物。另一个方面，本发明提供了包含载有活性聚合物的固相萃取载体的仪器。使用时，具有伯氨基的分析物吸附到活性聚合物上导致了荧光异吲哚络合物的形成。
在优选的实施方案中，活性聚合物包含邻苯二甲醛和烯丙基硫醇。聚合物最好还包括交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)和引发剂1，I’-偶氮二(环己腈)。如果用于聚合物制备的单体混合物中含有一种或多种有机试剂，例如乙腈、甲醇或三乙胺，则更佳。固相萃取载体适宜为柱、管、棒、试管或者平坦表面。固相萃取载体还可选择性地包含可与分析物选择性结合的非活性聚合物。本发明非常适用于吸附DNA、伏马菌素BI、阿替洛尔、戊二酸阿巴卡韦、维生素BI以及牛血清蛋白(BSA)。优选使用Toximet-T设备和/或透照仪进行检测荧光异吲哚络合物的形成。本发明的另一个方面，提供了一种分析样品的方法，包括以下步骤提供一个负载 着活性聚合物的固相萃取载体，其中的活性聚合物适合于结合具有伯氨基的分析物，这种结合可导致荧光异吲哚络合物的生成；将样品施加于活性聚合物；检测荧光发射的变化。此方法非常适用于分析例如DNA、伏马菌素BI、阿替洛尔、戊二酸阿巴卡韦、维生素BI或牛血清蛋白(BSA)这些化合物。理想情况下，可使用Toximet-T设备和/或透照仪检测荧光异吲哚络合物的荧光性。优选的聚合物包含邻苯二甲醛和烯丙基硫醇。如果聚合物进一步包含交联剂EGDMA和引发剂1，I’-偶氮二(环己腈)，则更佳。适当地，可使用包含乙腈和三乙胺的单体混合物制备聚合物。理想情况下，固相萃取载体还包含可以与分析物选择性结合的非活性聚合物。另一方面，本发明提供了作为固相萃取吸附剂的活性聚合物的使用，其用于定量分析分析物吸附。在优选实施方案中，活性聚合物由包含邻苯二甲醛、烯丙基硫醇、交联剂EGDMAdI发剂1，1’ -偶氮二(环己腈)、乙腈以及三乙烷的单体混合物制得。附图的简要说明图I为显示氨水的加入引起活性聚合物悬浮液的发射光谱变化的曲线图；图2为DNA吸附于活性聚合物后，使用Toximet-T仪器测得的荧光发射光谱图；图3为使用透照仪得到的DNA吸附于活性聚合物的图像；图4为不同量的DNA吸附于活性聚合物后，使用Toximet-T仪器测得的荧光发射光谱组图；图5为伏马菌素BI吸附于活性聚合物后，使用Toximet-T仪器测得的荧光发射光谱图；图6为使用透照仪得到的伏马菌素BI吸附于活性聚合物的图像；图7为阿替洛尔吸附于活性聚合物后，使用Toximet-T仪器测得的荧光发射光谱图；图8为戊二酸阿巴卡韦吸附于活性聚合物后，使用Toximet-T仪器测得的荧光发射光谱图；图9为使用透照仪得到的戊二酸阿巴卡韦吸附于活性聚合物的图像；
图10为维生素BI吸附于活性聚合物后，使用Toximet-T仪器测得的荧光发射光谱图；图11为使用透照仪得到的维生素BI吸附于活性聚合物的图像；图12为BSA吸附于活性聚合物后，使用Toximet-T仪器测得的荧光发射光谱图；图13为使用透照仪得到的BSA吸附于活性聚合物的图像。发明详述在优选实施方案中，制备了包含邻苯二甲醛、烯丙基硫醇、交联剂EGDMA、引发剂1，1’ -偶氮二(环己腈)、乙腈以及三乙烷的活性聚合物。聚合物制备成多孔型是为了增加用于结合分析物的活性聚合物的比表面积。在致孔剂的存在下，多孔聚合物由官能单体和交联剂聚合而成。致孔剂是一种可以分散在单体中(在单体反应过后，其残留分散于聚合物中)并在聚合物形成后可被除去使聚合物内部 生成孔洞的物质。合适的致孔剂是聚合反应惰性的。致孔剂可以是固体、液体或者气体。固体或液体可以通过分解或者使用合适溶剂“溶出”的方法除去。本发明的该优选实施方案中使用液体致孔剂，通过搅拌可将其很好地分散于聚合混合物中，又通过使用合适的溶剂洗涤聚合物可将其除去。当官能单体用EGDMA交联时，N，N-二甲基甲酰胺(DMF)为最合适的致孔剂。此夕卜，还可使用用于自由基聚合的乙腈、甲醇、甲苯、乙醇、丙三醇、水或其他溶剂或它们的混合物。将制得的活性聚合物负载于固相萃取柱后，便得到按照本发明所述的仪器。在分析测试前，使用缓冲液处理填充了活性聚合物的固相萃取柱。在优选的实施方案中，负载了活性聚合物的固相萃取载体适用的分析物包括DNA、伏马菌素BI、阿替洛尔、戊二酸阿巴卡韦、维生素BI以及牛血清蛋白(BSA)。在仪器的使用中，当含有伯氨基的分析物加载于活性聚合物时，根据下述反应机理，分析物上的伯氨基与活性聚合物相结合
I Ij** R-sI rO》
CiCO ‘^'
邻苯二甲醛荧光异吲哚
f
；| ■ f b 01)
硫代缩醛
f丨
f T 々 % - Kfijf
人 CH==O
硫代缩醛其中，R1-SH为烯丙基硫醇，R2-NH2为含有伯氨基的分析物。
荧光异吲哚络合物的生成会发射荧光。可使用Toximet-T仪器和/或透照仪检测此荧光发射。为了在接近固相萃取柱顶部处产生目标分析物的鲜明的光谱带，可在柱内活性聚合物中添加一种对目标分析物具有选择性的聚合物。实施例I :聚合物的制备聚合物的制备如文献“一种适用于共价固定和监测伯胺的新型活性聚合物(2001), Piletska E. V. , Piletsky S. A. , Subrahmanyam S. , Turner A. P. F. , Polymer,42,3603-3608” 所描述。准备聚合物混合物，包含2毫升交联剂EGDMA，134毫克邻苯二甲醛(OPA)，148毫克烯丙基硫醇(AT)，2毫升乙腈，6毫克三乙胺和100毫克引发剂1，I’ -偶氮二(环己腈)。混合物经氮气脱气后，于80°C下进行12小时的聚合反应。随后，将所得到聚合物 研磨并在甲醇中筛分，获得尺寸在45-125微米的部分。用甲醇充分洗涤这部分聚合物，干燥后填充于I毫升空固相萃取柱(Phenomenex,英国)内。在使用前，使用浓度为100毫摩尔/升、pH值为9. 5的硼酸钠缓冲液(BB)处理填充后的固相萃取柱。所有分析中，在目标分析化合物加载于填充柱前，均使用硼酸钠缓冲液对目标分析物进行稀释。制备的聚合物不具有明显的荧光性质。在用硼酸盐缓冲液处理后，聚合物的本底光散射是可接受的。因此，此聚合物适用于通过荧光异吲哚络合物形成的方法检测分析物的结合。在具有伯氨基团的化合物加载于填充后的固相色谱柱后，其荧光性质增强(见图I)。最大激发和发射波长分别为360纳米和434纳米。实施例2 =DNA使用购自Promega 的 DNA(100bp DNA 梯，产品目录号-G2101，Promega)。将 I 微升DNA溶解于I毫升BB (pH 9. 5)，然后加载于填充了实施例I中的活性聚合物的固相萃取柱(每根柱子中填充75毫克)。使用I毫升浓度为100毫摩尔/升、pH值为9. 5的BB预处理柱子。在DNA施加于填充后的固相萃取柱后,观察到突光增强(见图2和3)。将不同量的DNA分别加载于填充后的固相萃取柱，观测到累积效应(见图4)。实施例3 :伏马菌素BI将I微克伏马菌素BI稀释于I毫升BB (pH 7. 5),然后加载于填充了实施例I中的活性聚合物的固相萃取柱(柱子已用IOOmM BB(pH 9. 5)预处理)。
权利要求
1.一种仪器，包含载有聚合物的固相萃取载体，聚合物具有与分析物结合的官能单体，其中所述聚合物为活性聚合物，在使用时与具有伯氨基的分析物结合，引起荧光异吲哚络合物的形成。
2.如权利要求I所述的仪器，其中所述活性聚合物包含邻苯二甲醛和烯丙基硫醇。
3.如权利要求2所述的仪器，其中所述活性聚合物还包含交联剂EGDMA和引发剂1，I’ -偶氮二(环己腈)。
4.如前述权利要求之一所述的仪器，其中所述活性聚合物由包含乙腈和三乙胺的单体混合物制得。
5.如前述权利要求之一所述的仪器，其中所述固相萃取载体为柱、管、棒、试管或者平坦表面。
6.如前述权利要求之一所述的仪器，其中所述固相萃取载体还包含可与分析物选择性结合的非活性聚合物。
7.如前述权利要求之一所述的仪器，所述仪器适合于吸附DNA、伏马菌素BI、阿替洛尔、戊二酸阿巴卡韦、维生素BI或牛血清蛋白(BSA)。
8.如前述权利要求之一所述的仪器，所述仪器还包含Toximet-T设备和/或透照仪。
9.一种分析样品的方法，包括以下步骤 提供负载着活性聚合物的固相萃取载体，其中的活性聚合物适合于结合具有伯氨基的分析物，这种结合导致荧光异吲哚络合物的生成； 将样品施加于活性聚合物；及 检测荧光的变化。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述分析物为DNA、伏马菌素BI、阿替洛尔、戊二酸阿巴卡韦、维生素BI或牛血清蛋白(BSA)。
11.如权利要求9或10所述的方法,其中所述突光碎灭是通过使用Toximet-T设备和/或透照仪进行检测的。
12.如权利要求9一 11之一所述的方法，其中所述活性聚合物包含邻苯二甲醛和烯丙基硫醇。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述活性聚合物还包含交联剂EGDMA和引发剂1，I’ -偶氮二(环己腈)。
14.如权利要求12或13所述的方法，其中所述活性聚合物由包含乙腈和三乙胺的单体混合物而制得。
15.如前述权利要求之一所述的方法，其中所述固相萃取载体还包含可与分析物选择性结合的非活性聚合物。
16.活性聚合物作为固相萃取吸附剂以吸附具有伯氨基的分析物的用途，其中所述吸附引起荧光异吲哚络合物的形成。
17.如权利要求16所述的用途，其中所述活性聚合物包含邻苯二甲醛、烯丙基硫醇、交联剂EGDMA、引发剂1，1’ -偶氮二(环己腈)、乙腈和三乙胺。
18.如基本上在此描述并参见附图的一种仪器。
19.如基本上在此描述并参见附图的一种方法。
全文摘要
本发明公开一种通过与含伯氨基的分析物结合而用于固相萃取的仪器、方法和聚合物。所述聚合物是一种活性聚合物，其中分析物与该聚合物的结合引起荧光异吲哚络合物的形成。结合方法包括使用载有活性聚合物的固相萃取载体，如固相萃取柱。通过观察分析物施加于聚合物后荧光的变化来检测分析物的结合。可用例如荧光检测仪或透照仪检测荧光。在一个优选实施方案中，活性聚合物由包含乙腈和三乙胺的单体混合物而制得。
文档编号G01N21/77GK102713573SQ201080039746
公开日2012年10月3日 申请日期2010年8月26日 优先权日2009年9月3日
发明者O·皮莱斯卡, R·科克, S·皮莱斯基 申请人:拓克西密特有限公司