专利名称：Hpv18e7单克隆抗体、相关杂交瘤细胞株和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程和免疫学技术领域，更具体地，涉及单克隆抗体技术领域，特别是指一种HPV18E7单克隆抗体、相关杂交瘤细胞株和应用。
背景技术：
宫颈癌是女性生殖系统的常见恶性肿瘤，位居女性恶性肿瘤第二位。大量研究发现，人乳头瘤病毒HPV (human papilloma virus)是导致宫颈癌的元凶，还可以引起多种其它肿瘤，包括生殖道、乳腺、消化道及呼吸道癌症。HPV近年来在我国人群中的传播有增无减，故宫颈癌预防、治疗的研究工作非常重要。1949年，Sttauss首先在电镜下于疣体浸出液中观察到人乳头瘤病毒(HPV)颗粒。在1976年zur Hansen提出HPV可能是性传播致癌因素之后，HPV感染与宫颈癌关系的研究成为肿瘤病毒病因研究的热门课题。HPV是一种具有种属特异性的嗜上皮病毒，属双链闭环的小DNA病毒，包含约8000个碱基对。其中包括6个早期开放读码框架，El，E2，E4-E7共6个基因，负责编码病毒复制相关蛋白，2个晚期读码框架和I个非编码长控区。在早期开放读码框架中，E6和E7基因对细胞生长刺激最为重要，E6、E7编码的E6、E7蛋白引起宫颈上皮细胞永生化。而晚期读码框LI和L2基因分别编码HPV的主要和次要衣壳蛋白，组装成HPV的衣壳。高危亚型HPV的E6，E7蛋白导致正常上皮细胞转化成癌症细胞的因果关系已被科学证明。因此，需要提供一种HPV18E7单克隆抗体及分泌HPV18E7单克隆抗体的杂交瘤细胞，该杂交瘤细胞能稳定分泌HPV18E7单克隆抗体，为进一步研究HPV18E7的功能，用于癌症治疗癌症检测和的研究奠定基础。
发明内容
本发明的主要目的就是针对以上存在的问题与不足，提供一种HPV18E7单克隆抗体、相关制备方法、杂交瘤细胞株和应用，该HPV18E7单克隆抗体能特异性检测HPV18E7，可用于HPV18高危致癌病毒亚型的感染，及宫颈癌早期诊断的特异性检测。特异性高，反应灵敏，成本低，适于大规模推广应用。为了解决上述目的，在本发明的第一方面，提供了一种HPV18E7单克隆抗体，其特点是，所述HPV18E7单克隆抗体是对SEQ ID NO:2所示的蛋白能特异性结合的单克隆抗体。本发明中所述“特异性”是指单克隆抗体对相应抗原或近似抗原物质的识别能力。特异性高，对抗原的识别能力就强。因此，上述的HPV18E7单克隆抗体能够特异性识别和结合SEQ ID NO:2所示的蛋白。SEQ ID NO:2所示的蛋白可以直接合成，也可以通过基因工程方法制备。在本发明的一具体实施例中，SEQ ID NO:2所示的蛋白可以是由SEQ ID NO:1第I至312位核苷酸编码产生。制备本发明的单克隆抗体所用的抗原是通过基因工程的方法获得，利用在原核生物中表达含有编码本发明的抗原的多核苷酸序列SEQ ID N0:1。本领域的技术人员通常熟知适用于表达本发明的抗原的载体。可根据所选用的适当启动子和待表达的目的基因序列来选择适当的载体。可使用任何适当的宿主细胞表达本发明的抗原。适当宿主的例子包括:原核细胞如大肠杆菌、芽孢杆菌、链霉菌等。转导、转化或转染的方法是本领域已知的，包括，但不限于，病毒感染、氯化钙转染法、脂质体转染法、电穿孔法或微粒轰击法等。为了活化启动子、选择转化体或扩增所需的基因，可以在适当修饰的常规营养培养基中培养被转导、转染或转化的宿主细胞。培养中所使用的温度、PH值等培养条件一般都是由所选用的表达特定蛋白质的宿主细胞决定的，并且这些条件都是本领域技术人员熟知的。为了大量获得重组蛋白，可以采用诱导型启动子，并利用诱导物诱导基因的表达。实质上，“诱导物”可以是任何能诱导宿主中基因表达的物质，可以是化学物质或环境刺激。较佳地，所述单克隆抗体是采用SEQ ID NO:2所示的蛋白与已知标签形成的融合蛋白作为抗原免疫动物得到的。更佳地，所述单克隆抗体是采用所述融合蛋白作为抗原免疫小鼠得到的。更进一步地，所述单克隆抗体对HPV18E7有特异性。较佳地，所述单克隆抗体由保藏号为CGMCC N0.5714的杂交瘤细胞株产生。在本发明的第二方面，提供了一种杂交瘤细胞株，其特点是，所述杂交瘤细胞株用于产生上述的HPV18E7单克隆抗体，所述杂交瘤细胞株的保藏号为CGMCC N0.5714。上述杂交瘤细胞株已保藏在国际保藏单位之一 “中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”(China General Microbiological Culture Collection Center, CGMCCN0.5714，地址:中国北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码:100101)，保藏日期:2012年I月10日，分类命名为分泌抗HPV18E7单克隆抗体的杂交瘤细胞系。 上述的HPV18E7单克隆抗体的制备方法采用SEQ ID NO:2所示的蛋白与已知标签形成的融合蛋白作为抗原来制备的。较佳地，所述已知标签是，但不限于，组氨酸标签(His标签)、谷胱苷肽S-转移酶(GST标签),Trx标签、S-tag标签、HA标签、HSV标签、Myc标签或VSV-G标签。在本发明的一具体实施例中，所述已知标签是GST标签，与SEQ ID NO:2所示的蛋白形成GST-HPV18E7
融合蛋白。较佳地，所述融合蛋白免疫小鼠，取小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选出能够分泌对SEQ ID NO:2所示的蛋白有特异性反应的单克隆抗体的杂交瘤细胞，从所述杂交瘤细胞的培养上清液中或从注射所述杂交瘤细胞后的动物腹水中获取所述单克隆抗体。更佳地，所述杂交瘤细胞株的保藏号为CGMCC N0.5714。在本发明的一优选具体实施例中，以GST-HPV18E7融合蛋白作为抗原免疫小鼠，取小鼠的脾细胞与同系动物的骨髓瘤细胞进行融合。筛选能够产生目的抗体的杂交瘤细胞，进行克隆化培养，并建立杂交细胞株。上述方法仅是示例性的，例如可以用同样的方法免疫其他哺乳动物，将其脾细胞作为免疫细胞。还可以选择适宜的骨髓瘤细胞用于融合，例如用来自大鼠、小鼠或仓鼠的骨髓瘤细胞。免疫细胞与骨髓瘤细胞的融合可以按照常规方法进行。筛选产生目的抗体的杂交瘤细胞进行单克隆化。得到的产生本发明单克隆抗体的杂交瘤细胞株，可以在普通培养基中传代培养或者在液氮中长时间保存。从杂交瘤细胞收集本发明的单克隆抗体时，可以从杂交瘤细胞体外培养上清液中获得抗体，或者将杂交瘤细胞注入适宜的哺乳动物并从动物腹水中获取抗体。前一种方法适于获得高纯度的抗体，后一种方法适于大量获取抗体。通过上述方法获得的抗体，可以用常规方法纯化，例如盐析、凝胶过滤、亲和层析等方法。在本发明的第三方面，提供了上述的HPV18E7单克隆抗体在制备检测和/或辅助诊断人乳头瘤病毒感染所致宫颈癌或其它人类癌症的诊断工具中的应用。在本发明的第四方面，提供了一种免疫测定法，其特点是，所述免疫测定法采用上述的HPV18E7单克隆抗体。较佳地，所述免疫测定法是ELISA免疫测定法、免疫层析测定法、免疫细胞化学染色测定法或者免疫组化染色测定法。在本发明的第五方面，提供了一种试剂盒，其特点是，所述试剂盒包括上述的HPV18E7单克隆抗体。对于本领域的技术人员而言，根据本发明的内容，利用上述单克隆抗体，制备相应的检测产品，例如酶标试剂盒和/或快速检测试纸条等，是显而易见的。因此，也是本发明所要求保护的内容。本发明的有益效果在于:1、本发明的HPV18E7单克隆抗体是对SEQ ID NO:2所示的蛋白有特异性的单克隆抗体，可以特异性地结合SEQ ID NO:2所示的蛋白，从而可用于HPV感染的宫颈癌细胞，其细胞表达HPV18E7蛋白，HPV18E7按克隆抗体可提供特异性检测，特异性高。2、本发明的HPV18E7单克隆抗体对HPV18E7有特异性，从而可以进行由于HPV感染所致的人类正常细胞转化成癌前病变细胞(CIN)或癌细胞的特异性检测，弥补目前尚无HPV特异性检测方法之不足，·利用HPV18E7单克隆抗体进行检测特异性高，反应灵敏。3、本发明的免疫测定法和试剂盒可用于HPV阳性肿瘤细胞的种特异性检测，弥补目前尚无宫颈癌特异性检测方法之不足。HPV18E7单克隆抗体可以特异性结合肿瘤细胞中的生物标志物，HPV18E7蛋白。提供特异性高，反应灵敏，成本低诊断技术，适于高通量检测和大规模推广应用。
图1是融合小鼠6次免疫后血清效价的ELISA检测结果。图2是纯化后的HPV18E7单克隆抗体Hll的SDS-PAGE鉴定结果，其中，E1-E6为不同批次洗脱的单克隆抗体的编号。图3是纯化的HPV18E7单克隆抗体Hll和Fl分别与HPV18E7和HPV16E7L2的结
合检测结果。图4是SiHa，Hela细胞内源性HPV18E7的IP WB检测结果。图5是HPV18E7单克隆抗体E8，Fl，Hll分别对HPV阳性宫颈癌细胞Hela进行免疫细胞化学染色实验的结果，其中A为阴性对照小鼠IgG，B为E8，C为Fl，D为H11。图6是HPV18E7单克隆抗体Hll对宫颈鳞状细胞癌病理切片进行免疫组化实验的结果，其中A为阴性对照，B为HllmAb。
具体实施例方式本发明人经过广泛而深入的研究，获得一种HPV18E7单克隆抗体，该HPV18E7单克隆抗体对HPV18E7具有优异的特异性结合作用。在此基础上完成了本发明。为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例结合附图详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。1、实验材料和方法1.1试剂和药品弗氏完全、不完全佐剂(Freund，sAdjuvant complete or incomplete) ；PEG(Polyethyleenglycol4000*PEG*Macrogolum 4, OOOlot # BCBC0873),购自 Fluka 公司;辣根过氧化物酶标记羊抗鼠 IgG (Goat ant1-mouse IgG-HRP lot # 15-035-164),购自 Jackson 公司；DMEM(Dulbecco’ s Modified Eagle Medium, lot # SH3002.01B),购自 HyClone 公司；胎牛血清，购自Hyclone公司；TMB (Tetramethylbenzidine),购自Sigma公司；鼠单克隆抗体亚类分型试剂盒(Mouse Monoclonal Antiboay Isotyping Reagents,058K4836) ;IHC试剂盒(Dako, EnVision+ System-HRP Labelled Polymer Ant1-mouse, K4000);其它相关试剂均为优级纯或分析纯。1.2仪器与耗材超净化工作台(Boxun购自上海博迅实业有限公司医疗设备厂)；C02恒温培养箱(德国Thermo);超 低温冰箱(Forma_86C德国Thermo) ;YDS_50B_125型液氮生物容器(成都金凤液氮容器有限公司)；普通显微镜(XDS-1A);电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；85-1恒温磁力搅拌器(江苏金坛市杰瑞尔电器有限公司)；台式高速冷冻离心机(德国Eppendorf) ;HHS型电热恒温水浴锅(上海博迅实业有限公司医疗设备厂);MULTISKAN MK3酶标仪(Thermo公司);超纯水制备装置(美国MILLPORE公司)；GZX-9240MBE数显鼓风干燥箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)；WellWASK4MK2洗板机(购自Thermo公司)；96孔、24孔细胞培养板(NUNC公司)；96孔酶标板(NUNC公司)。单道、多道移液器(德国Eppendorf公司)；细胞培养瓶、改良牛鲍氏血细胞计数板等。1.3细胞株、组织标本和动物SP 2/0骨髓瘤细胞，细胞系SiHa，Hela:SP2/0由北京肿瘤医院寿成超老师实验室赠送，细胞系SiHa，Hela购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。组织切片:肿瘤切片购买于西安艾丽娜生物科技有限公司。4 6周龄雌性BALB/c小鼠:购买于扬州大学实验动物中心。1.4主要溶液系统包被缓冲液(碳酸盐溶液):取0.2mol/L Na2C038mL,与 0.2mol/L NaHCO317mL 混合，再加75mL双蒸水，调pH值到9.6。稀释缓冲液(PBS，无钙和镁):洗涤缓冲液(PBS-Tween20，0.5%。):Tween-200.5mL，加入到 IL 稀释缓冲液
(PBS)中，搅拌混匀，调pH值到7.0 7.2之间。
20 X底物使用液A:取TMB 21mg，充分溶解于5mL乙醇中。100X底物使用液B:取尿素过氧化氢16.5mg，溶解于ImL双蒸水中。终止液(2mol/LH2SO4):双蒸水 178.3mL，滴加浓硫酸(98% )21.7mL。不完全DMEM培养基:购于Hyclone公司。完全DMEM培养基:购于Hyclone公司。HAT培养基:完全DMEM培养基99ml，加500 X HAT贮存液Iml，无菌条件下配制。1.5单克隆抗体的制备1.5.1抗原制备:制备原核表达载体表达GST-HPV18E7(见SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列)作为免疫抗原，以His-HPV18E7(见SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列)作为检测抗原。其余涉及的检测原核蛋白序列为:GST-HPV16E7(见SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列)，His_HPV16E7L2 (见SEQ ID N0:6所示的氨基酸序列)，HPV18E7-P1 (见SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列)，HPV18E7-P2 (见SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列)。1.5.2小鼠免疫程序
以GST-HPV18E7为免疫原，免疫程序见表I。表I小鼠免疫程序
权利要求
1.一种HPV18E7单克隆抗体，其特征在于，所述HPV18E7单克隆抗体是对SEQ ID NO:2所示的蛋白能特异性结合的单克隆抗体。
2.根据权利要求I所述的HPV18E7单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体是采用SEQ ID NO :2所示的蛋白与已知标签形成的融合蛋白作为抗原免疫动物得到的。
3.根据权利要求2所述的HPV18E7单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体是采用所述融合蛋白作为抗原免疫小鼠得到的。
4.根据权利要求3所述的HPV18E7单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体对HPV18E7有特异性。
5.根据权利要求I所述的HPV18E7单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由保藏号为CGMCC No. 5714的杂交瘤细胞株产生。
6.一种杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株用于产生根据权利要求I所述的HPV18E7单克隆抗体，所述杂交瘤细胞株的保藏号为CGMCC No. 5714。
7.根据权利要求I所述的HPV18E7单克隆抗体在制备检测和/或辅助诊断人乳头瘤病毒感染所导致的人类癌症疾病的诊断工具中的应用。
8.一种免疫测定法，其特征在于，所述免疫测定法采用根据权利要求I所述的HPV18E7单克隆抗体。
9.根据权利要求8所述的免疫测定法，其特征在于，所述免疫测定法是ELISA免疫测定法、免疫层析测定法、免疫细胞化学染色测定法或者免疫组化染色测定法。
10.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括根据权利要求I所述的HPV18E7单克隆抗体。
全文摘要
本发明提供了人乳头瘤病毒HPV高危致癌亚型HPV18单克隆抗体，是对SEQ IDNO2所示的HPV18E7致癌蛋白能特异性结合的单克隆抗体，较佳地，采用SEQ IDNO2所示的蛋白与已知标签形成的融合蛋白作为抗原免疫动物得到，由保藏号为CGMCC No.5714的杂交瘤细胞株产生。还提供了相关的杂交瘤细胞株以及抗体的应用技术，用以检测生物标志物(biomarker)，特别是肿瘤细胞特异性表达的HPV致癌蛋白。本发明的HPV18E7单克隆抗体能特异性检测HPV18E7，可以作为高灵敏度、高特异性试剂，用于癌症检测方法的建立，如开发体外试剂盒产品。此抗体能特异性结合HPV病毒转化的宫颈癌细胞，可以用于进行癌症治疗的研究，开发靶向治疗药物。此抗体用于检测试剂特异性高，反应灵敏，成本低，适于大规模推广应用。
文档编号G01N33/577GK103254307SQ201210033918
公开日2013年8月21日 申请日期2012年2月16日 优先权日2012年2月16日
发明者常小迦 申请人:艾托金生物医药(苏州)有限公司