专利名称：一种肺炎支原体mp检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明提供一种肺炎支原体MP检测试剂盒，具体是一种基于荧光PCR的MP-DNA检测试剂盒。
背景技术：
肺炎支原体(mycoplasma pneumoniae, MP)是介于细菌和病毒之间的一种超过滤性病原微生物，主要通过呼吸道飞沫以气溶胶微粒的形式传播。1962年首先从人类原发性非典型肺炎(primary atypical pneumonia, PAP)患者的痰液中分离和培养而来。20世纪90年代以来，随着肺炎病原学的变迁，MP已成为小儿肺炎的重要病原体，MP感染不仅引起肺部病变，且能侵犯心、脑、肝、肾等其他器官，引起多种肺外表现。MP还是社区获得性肺炎(CAP)的重要病原，尤其是5岁以上小儿，MP在非流行年占CAP病原1(Γ20%。因MP生长缓慢、潜伏期及带菌时间长，形成间歇期发病缓慢、长时期传播的流行特点，流行可达数月至数年。近些年来，流感人群比例逐年增加，不仅侵犯青少年和儿童，婴幼儿发病率也呈增多趋势，且由于MP感染常无特异性临床表现，容易与一般的病毒性感冒相混淆，因此能够及时确诊何种病因致病，做到早发现早治疗，减少儿童急性肺炎病情恶化，故早期诊断极为重要。目前MP感染常用的实验室诊断方法有血清学检查及基于PCR技术的检测方法等。血清学检查是重要的诊断MP感染的方法，血清学检测技术有补体结合试验(CFA)、间接免疫荧光技术(IFA)、颗粒凝集法(PA)以及酶联免疫吸附法(ELISA)等。检测儿童MP感染最常用的血清学方法是酶联免疫吸附法；酶联免疫吸附法因其具有高度的特异性和敏感性而被广泛应用，但仍存在无法排除的干扰因素，其定性结果仍需结合临床表现、病史及其他诊断结果才能最后判 定支原体感染。近年来，聚核酶链式反应(PCR)法渐渐显现了其在检测上的优势，荧光PCR技术是基于传统PCR技术并结合光谱技术而发展起来的一种更灵敏，更特异，更精确的核酸检测技术。检测结果准确，重复性高，能动态反应患者治疗前、后病原体动态变化及与临床的关系，且整个过程中避免了传统PCR需后处理的问题，减少了污染。定量PCR的出现，打破PCR只能定性的局面，其中荧光定量PCR以其高灵敏度、高特异性、低污染率、实时监测等特点，可为临床提供更加准确、客观的检测结果，并及时地了解病情及预后。运用PCR技术进行检测主要涉及到两个方面，核酸的提取和核酸的扩增检测。目前国内临床上主要采用直接煮沸法对痰液及咽拭子样本中的肺炎支原体核酸进行提取，具体是先将样本浓缩，再加裂解液，煮沸，高速离心，上清为模板；该方法核酸提取过程较复杂，样本处理耗时长，且在处理样本时经过煮沸裂解、高速离心富集DNA等多个步骤，样本中的DNA存在损耗，尤其对高浓度的样本裂解不充分、富集不完全，会造成DNA的大量丢失导致样本定量偏低，同时由于采用了水浴或金属浴的高温加热步骤，容易造成气溶胶污染；浓缩这一步，不同厂家的浓缩效果不一样，有的可以看到沉淀，有的无法看到，看得到沉淀的是因为将核酸与蛋白都浓缩了，这样会导致后面加入裂解液时很难充分混匀；无法看到沉淀则使操作者无法确定吸弃上清时会不会吹打到核酸。临床上检测MP-DNA的方法目前主要是基于实时荧光定量PCR的技术及其改进，实时荧光定量PCR技术是近年来发展迅速的一种核酸检测技术，使用一种带有荧光检测装置的PCR扩增仪，荧光检测装置能够按照一定的程序周期性地发出特定波长的激发光，收集检测荧光信号，通过检测荧光信号的动态变化实时反映PCR的每个循环的扩增水平，试验结束后可通过软件自动分析获得扩增曲线，根据扩增曲线与荧光阈值线的交点(即Ct值)以及扩增曲线的形状，可以判断阴阳性结果；如果同一反应中有已知浓度的定量参考品或标准品，则可以通过软件自动分析获得标准曲线，由此实现对未知样本的定值(即定量检测)。与传统的PCR相对比，其在反应体系中增加了一条两端分别标记荧光报告基团和淬灭基团的探针。探针结构完整时，荧光报告基团发出的荧光能量被淬灭基团吸收，呈现淬灭效应；如果扩增过程中有靶序列的存在，随着目标片段的延伸，探针分子逐渐被Taq酶水解切断，荧光报告基团与淬灭基团相互解离，阻断了二者间荧光能量转移效应，荧光报告基团发出的荧光信号被荧光检测装置收集。随着扩增的进行，荧光信号随着目的片段的扩增而呈现线性增强。试验结束后，可以通过荧光PCR仪自带的软件自动分析数据，可以获得阴阳性结果和样本浓度的定值结果，因此，该技术在靶多核苷酸样品的检测和定量分析中，已逐渐取代传统的PCR方法，得到十分广泛的应用。目前国内外已有基于实时荧光定量PCR技术定量检测MP-DNA的试剂盒应用于临床检测中，但这些试剂盒多半以煮沸法提取核酸，且其检测灵敏度不高，约在50(Tl000copies/ml左右；另外,这些试剂盒大多缺乏完善的质控体系,还需要进一步完善和提高技术水平，使此类产品更加满足临床准确诊断的需要。
发明内容
本发明提供一种核 酸释放剂在肺炎支原体MP检测中的应用，所述核酸释放剂包含莎梵婷(surfactin)O. θΓθ. 5mM/L，氯化钾2(T300mM/L，十二烷基磺酸钠O. 01 2%和乙醇
O.05 1%。在本发明所述核酸释放剂中，其溶剂可以为本领域常用的，例如为无菌水或TE缓冲液。本发明首次披露在肺炎支原体MP检测中使用含强蛋白变性剂的核酸释放剂，在很大程度上简化了该核酸检测的步骤，而且检测灵敏度有了很大的提高。本发明提供一种肺炎支原体MP检测试剂盒，所述试剂盒中包括核酸释放剂和PCR反应液，所述核酸释放剂包含莎梵婷(surfactin) O. θΓθ. 5mM/L，氯化钾2(T300mM/L，十二烷基磺酸钠0. 0Γ2%和乙醇0. 05^1% ;所述PCR反应液中包含用于靶多核苷酸扩增的上游引物、下游弓I物和用于靶多核苷酸检测的探针。使用本发明试剂盒中的核酸释放剂释放核酸的方法与煮沸法提取核酸的检测结果没有明显差异，而本发明中提取核酸时采用强烈的蛋白变性剂，快速破坏病原体外壳蛋白结构，释放出病原体核酸，无需加热即可完成DNA的释放和提取；本发明试剂盒检测MP的灵敏度可达400copies/ml,定量线性范围为400 4. 00E+09copies/ml。具体的，用于靶多核苷酸的上游引物序列为5 ’ -CCCACTCGCTGAACTGTTAGAT-3 ’ ；下游引物序列为5’ -GGGTAAACAAGCGGTTGAAGT-3’ ；用于靶多核苷酸的探针序列为5’ -CTGACACTGGTCCACAAAGCGTGAA-3’。本发明的试剂盒因采用用于检测靶多核苷酸的上述引物和/或探针序列，具有很好的特异性。在本发明中，优选的是，所述试剂盒中还包括用于将未知样本浓缩的MP浓缩液，所述MP浓缩液包括l(Tl00mM/L的聚乙二醇6000和5(T500mM/L的氯化钠溶液。在血清样本加入MP浓缩液进行浓缩后，能更好地进行随后的MP-DNA核酸释放和检测。本发明中，优选所述试剂盒中还包括内标，所述内标的序列为5’ -CCTCTAGCGCTGCGAATAGAACTTCCTCTGTTCAAGCCTTCCCTTTATACGCTCAAGCTGGTTCTTCTTCAAGGTTCAAGCAATAGAAACGGAGATCTAC-3 ’。本发明中所述内标为插入pUC18T载体的一段长为100碱基对的人工合成DNA序列的重组体，即质粒，它作为PCR扩增体系中的阳性内对照，预防由于样本中可能存在的PCR干扰物质导致的假阴性。在所述试剂盒中包含内标的情况下，所述PCR反应液中还包括用于内标检测的上游引物、下游引物和探针；内标上游引物序列为5 ’ -CCTCTAGCGCTGCGAATAGAA-3 ’，内标下游引物序列为5’-GTAGATCTCCGTTTCTATTGCTTGA-3’，内标探针序列为 5 ’-TCAAGCCTTCCCTTTATACGCTCAAGC-3，。优选本发明所述试剂盒中还包括酶混合液，所述酶混合液中包含耐热DNA聚合酶(Taq酶)和O. 5^2U/ μ I的尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)，同时在所述PCR反应液中还包含dUTP。其中UNG酶的功能是降解含有dU的PCR产物，利用UNG酶和PCR反应液中的dUTP可以起到预防PCR产物污染的作用，从而防止样本检测假阳性。在一个具体实施方式
中，所述试剂盒中还包括MP定量参考品、MP阳性对照和MP阴性对照。本发明还提供一种MP检测试剂盒，所述试剂盒中包括PCR反应液，所述PCR反应液中包含用于靶多核苷酸扩增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸检测的探针，且用于靶多核苷酸的上游引物序列为5’ -CCCACTCGCTGAACTGTTAGAT-3’;用于靶多核苷酸的下游引物序列为 5’ -GGGTAAACAAG CGGTTGAAGT-3’。本发明又提供一种MP检测试剂盒，所述试剂盒中包括PCR反应液，所述PCR反应液中包含用于靶多核苷酸扩增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸检测的探针，且用于靶多核苷酸的探针序列为5’ -CTGACACTGGTCCACAAAGCGTGAA-3’。本发明还具体提供一种MP检测试剂盒，所述试剂盒中包括MP浓缩液、核酸释放剂、PCR反应液、内标、酶混合液、MP定量参考品、MP阳性对照和MP阴性对照；且所述核酸释放剂中包含莎梵婷(surfactin) O. θΓθ. 5mM/L,氯化钾2(T300mM/L，十二烷基磺酸钠O. 0Γ2%,乙醇O. 05^1%和溶剂TE缓冲液；所述PCR反应液中包含用于靶多核苷酸扩增和检测的上游引物、下游引物和探针，用于内标扩增和检测的上游引物、下游引物和探针，10XPCR反应缓冲液，脱氧核糖核苷三磷酸和/或核糖核苷三磷酸dNTP ;所述内标为插入PUC18T载体的一段长为100碱基对的人工合成DNA序列的重组体；所述酶混合液中包含DNA聚合酶和尿嘧啶DNA糖基化酶。本发明提供的MP荧光定量PCR检测试剂盒操作快速、方法简便、检测灵敏度高、检测范围宽，应用该试剂盒可以对痰液、咽拭子等未知样本中的MP-DNA进行快速准确的检测，为诊断肺炎支原体感染提供可靠的实验依据。
图1中①为实施例中MP-DNA检测结果为阳性的待测样本的扩增曲线，图1中②为实施例中MP-DNA检测结果为阴性的待测样本的扩增曲线。
具体实施例方式以下仅为本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不局限于此，任何本领域的技术人员在本发明公开的技术范围内，可很容易进行的改变或变化都涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求书的保护范围为准。实施例1本实施例提供一种具体的肺炎支原体检测试剂盒，它包括如下组分①MP浓缩液包含50mM/L的聚乙二醇6000 (PEG-6000)和100mM/L的氯化钠。②核酸释放剂包含莎梵婦(surfactin) O.1mM/L,氯化钾100mM/L,十二烧基磺酸钠(SDS) O. 1%, O. 1%的乙醇和溶剂TE缓冲液。③内标(阳性内对照)为插入PUC18T载体的一段长为100碱基对的人工合成DNA序列的重组体，即质粒，浓度为2. 00E+04copies/ml, 100碱基对的序列为5’ -CCTCTAGCGCTGCGAATAGAACTTCCTCTGTTCAAGCCTTCCCTTTATACGCTCAAGCTGGTTCTTCTTCAAGGTTCAAGCAATAGAAACGGAGATCTAC-3’。④PCR反应液包括10XPCR反应缓冲液5 μ 1，0. 2mmol/L的dNTP，用于靶多核苷酸扩增的上、下游引物均为0.3μπιΟ1/1，用于靶多核苷酸检测的探针为0.3μπιΟ1/1，用于内标片段扩增的上下游引物均为0.3 μ mol/L，用于检测内标的探针为O.1 μ mol/L。其中，所述10XPCR反应缓冲液为包括pH7. 5的200mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液、30mmol/L氯化镁溶液、500mmol/L氯化钾 溶液、0. 2%的曲拉通溶液和10%的甲酰胺溶液；所述dNTP包括dATP、dCTP、dUTP和dGTP ;所述用于靶多核苷酸扩增的上下游引物及用于靶多核苷酸检测的探针是源于肺炎支原体核酸的保守区域的引物和探针，其碱基对序列分别为上游引物5’ -CCCACTCGCTGAACTGTTAGAT-3’，下游引物5’ -GGGTAAACAAGCGGTTGAAGT-3’，探针5’ -CTGACACTGGTCCACAAAGCGTGAA-3’ ；所述的用于检测内标的引物探针序列分别为，上游引物5’ -CCTCTAGCGCTGCGAATAGAA-3’，下游引物5’ -GTAGATCTCCGTTTCTATTGCTTGA-3’，探针5’ -TCAAGCCTTCCCTTTATACGCTCAAGC-3’。⑤酶混合液包含5U/ μ I的耐热DNA聚合酶(Taq酶)和IU/ μ I的尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)。⑥MP定量参考品来源于使用MP企业定量线性参考品LfL5定值后的MP强阳性质粒，该MP定量参考品包括A、B、C、D四个浓度组成的梯度参考品，其浓度分别为 4. 00E+07copies/ml (Α)、4· 00Ε+06copies/ml (Β)、4·00E+05copies/ml (C)、4.00E+04copies/ml (D)0⑦MP阳性对照为临床医院收集的已灭活的MP强阳性咽拭子样本，经浓缩离心后，加入灭菌生理盐水溶解沉淀，并经合格的MP试剂盒检测并定值后，用灭菌生理盐水稀释至浓度为 4. 00E+05copies/ml。⑧MP阴性对照临床医院收集的已灭活的MP阴性咽拭子样本，用灭菌生理盐水稀释100倍后，经合格的MP试剂盒检测为阴性。实施例2
本实施例提供上述实施例1所述试剂盒用于检测痰液及咽拭子等未知样本中MP-DNA的操作步骤一、试剂准备根据待测样本、MP阴性对照、MP阳性对照以及MP定量参考品A D的数量，按比例取相应量的PCR反应液(38μ I/人份)、酶混合液(2μ I/人份)及内标O. 4μ I/人份，充分混匀成PCR-mix，例如待测样本为3人份时，一共需配制9人份(上述四者的人份数分别为3、1、I和4)的PCR-mix ;瞬时离心后备用。二、核酸提取1.痰液用枪头挑取适量痰液置于1. 5ml灭菌离心管中，加入Iml生理盐水，充分震荡混匀后静置一个小时使痰液液化，液化后的痰液样本混匀后吸取100 μ I至1. 5ml离心管中，加入MP浓缩液100 μ 1，12，OOOrpm离心5min，弃上清(建议有20 μ I残留)，沉淀中力口入50μ I核酸释放剂，震荡或移液枪吸打混匀，作为待测样本备用。2.咽拭子往样本收集管中加入Iml无菌生理盐水，充分振荡混匀，然后把全部液体(样本洗脱液)倒入1. 5ml灭菌离心管中(棉拭子靠离心管壁挤干后丢弃)，混匀后吸取100 μ I至另一1. 5ml离心管中加入MP浓缩液100 μ 1,12, OOOrpm离心5min,弃上清(建议有20μ I残留)，沉淀中加入50μ I核酸释放剂，震荡或移液枪吸打混匀，作为待测样本备用。
3. MP阴性对照、MP阳性对照、MP定量参考品ΜΡ阴性对照、MP阳性对照、MP定量参考品Al分别取10 μ I与10 μ I核酸释放剂混匀待用。三、向PCR反应管中加样每个PCR反应管中加入上述第二步骤中处理后的待测样本、MP阴性对照、MP阳性对照以及MP定量参考品A D各10 μ I ;静置10分钟后，每管加入步骤一中的PCR-miX40l·! 1，吸打混匀2-3次，去除气 泡后盖上管盖，2000rpm离心30秒。四、荧光PCR反应与结果分析(在荧光定量PCR扩增仪上进行)I)将PCR反应管放入扩增仪样品槽，按对应顺序设置待测样本名称及定量参考品浓度。2)突光检测通道选择选择FAM通道(Reporter: FAM, Quencher: None )检测MP ;选择 HEX 或 VIC 通道(Reporter: VIC, Quencher:None)检测内标；参比突光(PassiveReference)设置为 none。3)荧光定量PCR反应条件见表1:表I
权利要求
1.一种核酸释放剂在肺炎支原体MP检测中的应用，所述核酸释放剂包含莎梵婷(surfactin)O. θΓθ. 5mM/L，氯化钾 2(T300mM/L，十二烷基磺酸钠 O. 01 2%和乙醇 O. 05 1%。
2.一种肺炎支原体MP检测试剂盒，所述试剂盒中包括核酸释放剂和PCR反应液，所述核酸释放剂包含莎梵婷(surfactin) O. θΓθ. 5mM/L,氯化钾2(T300mM/L，十二烷基磺酸钠0.Of 2%和乙醇0. 05^1% ;所述PCR反应液中包含用于靶多核苷酸扩增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸检测的探针。
3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，用于靶多核苷酸的上游引物序列为5 ’ -CCCACTCGCTGAACTGTTAGAT-3 ’；用于靶多核苷酸的下游引物序列为5， -GGGTAAACAAGCGGTTGAAGT-3，。
4.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，用于靶多核苷酸的探针序列为5’-CTGACACTGGTCCACAAAGCGTGAA-3’。
5.根据权利要求2 4中任意一项所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括用于将未知样本浓缩的MP浓缩液，所述MP浓缩液包括l(Tl00mM/L的聚乙二醇6000和5(T500mM/L的氯化钠溶液。
6.根据权利要求2 4中任意一项所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括内标，所述内标的序列为 5 ’ -CCTCTAGCGCTGCGAATAGAACTTCCTCTGTTCAAGCCTTCCCTTTATACGCTCAAGCTGGTTCTTCTTCAAGGTTCAAGCAATAGAAACGGAGATCTAC-3，。
7.根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液中还包括用于内标检测的上游引物、下游引物和探针；内标上游引物序列为5’ -CCTCTAGCGCTGCGAATAGAA-3’，内标下游引物序列为5’ -GTAGATCTCCGTTTCTATTGCTTGA-3’，内标探针序列为5’ -TCAAGCCTTCCCTTTATACGCTCAAGC-3’。
8.根据权利要求2 4中任意一项所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括酶混合液，所述酶混合液中包含耐热DNA聚合酶(Taq酶)和0. 5^2U/ μ I的尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)，同时在所述PCR反应液中还包含dUTP。
9.一种MP检测试剂盒，所述试剂盒中包括PCR反应液，所述PCR反应液中包含用于靶多核苷酸扩增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸检测的探针，且用于靶多核苷酸的上游引物序列为5’ -CCCACTCGCTGAACTGTTAGAT-3’ ；用于靶多核苷酸的下游引物序列为5， -GGGTAAACAAGCGGTTGAAGT-3，。
10.一种MP检测试剂盒，所述试剂盒中包括PCR反应液，所述PCR反应液中包含用于靶多核苷酸扩增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸检测的探针，且用于靶多核苷酸的探针序列为 5’ -CTGACACTGGTCCACAAAGCGTGAA-3’。
全文摘要
本发明提供一种肺炎支原体MP检测试剂盒，所述试剂盒中包括核酸释放剂和PCR反应液，所述核酸释放剂包含莎梵婷(surfactin)0.01~0.5mM/L，氯化钾20~300mM/L，十二烷基磺酸钠0.01~2%和乙醇0.05~1%；所述PCR反应液中包含用于靶多核苷酸扩增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸检测的探针。使用本发明核酸释放方法与煮沸法提取核酸的检测结果无明显差异，而本发明中提取核酸时采用强烈的蛋白变性剂，快速破坏病原体外壳蛋白结构，释放出病原体核酸，无需加热即可完成DNA的释放和提取；本发明试剂盒检测MP的灵敏度可达400copies/ml，定量线性范围为400~4.00E+09copies/ml；应用该试剂盒可以对痰液、咽拭子等未知样本中的MP-DNA进行快速准确的检测，为诊断肺炎支原体感染提供可靠的实验依据。
文档编号G01N21/64GK103060451SQ20131000901
公开日2013年4月24日 申请日期2013年1月10日 优先权日2013年1月10日
发明者戴立忠, 邓中平, 艾颖娟 申请人:湖南圣湘生物科技有限公司