一种单分散性空心金纳米球及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种单分散性空心金属纳米球，所述单分散性空心金属纳米球具有单分散性的空心内核和单分散性的金属纳米外层，所述金属纳米外层为金纳米层、银纳米层、铜纳米层或铂纳米层中的一种或几种，所述单分散性的空心内核是通过腐蚀单分散的有机或无机纳米球而成。本发明与以前发明的空心金属纳米球相比，本发明的空心金属纳米球单分散性好。这样，用这种单分散性良好的空心金属纳米球制备而成的SERS探针具有非常良好的均一性、灵敏度和可重复性的免疫分析特性。在生物标志物的定量分析中有利于高精度定量检测。
【专利说明】
一种单分散性空心金纳米球及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种增强拉曼材料制备的【技术领域】，更具体地，涉及一种单分散性空心金纳米球及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]在基于表面增强拉曼散射(SERS)检测的免疫分析研究及应用中，空心金属纳米常用作SERS标记的探针，构建高灵敏度、均一性和信号可重复性的夹心免疫分析。用于常见的肿瘤标志物的超灵敏检测，可以提供很多有用的诊断数据。先前制备的空心金属纳米球通常都是通过钴纳米球为核，并在其表面生长金壳层；然后再去除钴纳米核，得到空心的金属纳米球。然而，由于目前的钴纳米球制备技术还不能够实现单分散性钴纳米球的制备，所以这种方法不能获得均一性的空心金纳米球，这对后续的夹心免疫分析的定量分析有影响。
[0003]在大多数发展中国家，恶心肿瘤(即癌症)是第二大死亡率最高的疾病，它影响了人体超过60个人体器官。目前已知的癌症有200多种，其中肺癌是死亡人数最多的，占全部癌症的1/4。为了癌症病人提高存活率和预后评估，早期的临床诊断室非常重要和必要的。但是肺癌早期的诊断遇到了许多挑战，因为肺癌早期一般是没有明显特异症状的，例如咳嗽，气短，消瘦。过去的几十个世纪，许多技术被开发并用于癌症检测，包括CT、NMR、胸部X光、PET-CT等等。但是它们也有很大的缺点:昂贵、费时、低灵敏度。
[0004]生物标志物是细胞生理状态的指标并随着疾病的发生发展而改变。血清生物标志物在肿瘤早期诊断和评估治疗效果中都非常有用。传统用于抗原抗体检测的技术有RIA、FIA、ELISA、ECIA等等。他们之中荧光免疫分析由于其高灵敏度和低检测限度被广泛用于生物分析。但是，它的宽激发带限制了其运用。
【发明内容】
[0005]发明目的:本发明的第一个目的是提供一种单分散性空心金属纳米球，作为SERS探针材料具有非常良好的均一性、灵敏度和可重复性的免疫分析特性。本发明的第二个目的是提供上述单分散性空心金属纳米球的制备方法。本发明的第三个目的是提供上述单分散性空心金属纳米球在制备SERS探针中的应用。
[0006]在本发明中，首先，以用单分散性无机或有机的纳米球为核，再在这核上沉积金属形成单分散性好的金属纳米壳，最后去除金属纳米壳的核即得空心金属纳米球。目前有机或无机的纳米球制备技术成熟，制备的纳米球单分散性好。本发明选择有机或无机的单分散性好的纳米球为核，制备单分散性好的金纳米壳，再进一步去除核即得到单分散性好的空心金纳米球。用这种单分散性良好的空心金纳米球制备而成的SERS探针具有非常良好的均一性、灵敏度和可重复性的免疫分析特性。
[0007]为了很好的解决第三个技术问题，我们发明了一种可行性很高的免疫分析用于快速可重复的检测肿瘤生物标志物如癌胚抗原(CEA)和甲胎蛋白(AFP)等，该方法是基于SERS并用单克隆抗体修饰的空心金属纳米球，该空心金属纳米球是通过氢氟酸等腐蚀金属纳米壳的核而形成的，它表现了比金纳米壳更强的SERS活性是由于空心金属纳米结构表面的小孔结构。由于整个反应过程都是在液相中的，克服了在固相表面带来的扩散限制引起的反应慢问题。由于其表面热点引起局部电磁场增强，空心金属纳米球起到了很好的SERS增强效果。因此，它被用于构建SERS探针并用于生物标志物的高灵敏免疫分析，先前制备的空心金纳米球通常都是通过钴纳米球为模板，并在其表面生长金壳层。然而，这种方法不能获得均一性的空心金属纳米球，对之后的定量分析有影响。这里，我们提出一种新的空心金属纳米球制备方法通过氢氟酸腐蚀单分散良好的单分散金纳米壳(GNSs)的二氧化硅核。用这种单分散性良好的空心金属纳米球制备而成的SERS探针具有非常良好的均一性、灵敏度和可重复性并用于免疫分析。CEA和AFP是一种最常见的肿瘤标志物之一，血清CEA和AFP也可以当成术前测试的有用预测数据，有研究表明肿瘤患者比健康人群的CEA和AFP水平高。
[0008]技术方案:为了解决上述技术问题，本发明的技术方案如下:一种单分散性空心金属纳米球，所述单分散性空心金属纳米球具有单分散性的空心内核和单分散性的金属纳米外层，所述金属纳米外层为金纳米层、银纳米层、铜纳米层或钼纳米层中的一种或几种，所述单分散性的空心内核是通过腐蚀单分散的有机或无机纳米球而成。
[0009]其中，上述单分散性空心内核直径为40-800纳米。
[0010]其中，上述金属纳米外层厚度为20-500纳米。
[0011]上述的一种单分散性空心金属纳米球的制备方法，包括以下步骤:
1)I?25ml新鲜配置IM的氢氧化钠加入500?1000 ml水中，搅拌，紧接着加入50-1000μ I四羟甲基氯化磷，磁力搅拌2-20分钟后得到混合液，5-100 ml 1%氯金酸加入混合液中，磁力搅拌1(Γ50分钟即得2?3 nm的金纳米颗粒，4°C避光保存；
2)将单分散的有机或无机纳米球的乙醇悬浮液与10(Γ400μ I的3-氨丙基三乙氧基硅烷通过6(T80°C搅拌f 4小时来氨基化，乙醇洗涤去除游离3-氨丙基三乙氧基硅烷即得氨基化纳米球；
3)将经步骤2)处理的氨基化纳米球加入步骤I)处理的金纳米颗粒，磁力搅拌1(Γ50分钟后离心去除没有吸附的金纳米颗粒即得金属纳米壳前体；
4)将经步骤3)处理的金属纳米壳前体加到金、银、铜或钼的盐溶液中，在加入还原剂磁力搅拌1(Γ50分钟后，离心收集沉淀即得金属纳米壳；
5)将经步骤4)处理的金属纳米壳加到氢氟酸或甲苯中去除内核即得单分散性空心金属纳米球。
[0012]所述有机或无机纳米球为二氧化娃纳米球、二氧化钛纳米球、聚苯乙烯纳米球,聚四氟乙烯纳米球。
[0013]进一步地，所述步骤4)中的还原剂为甲醛、过氧化氢或盐酸羟铵。
[0014]上述的一种单分散性空心金属纳米球在制备SERS探针中的应用。
[0015]进一步地，所述SERS探针是通过吸附在单分散性空心金属纳米球表面的拉曼信号分子并偶联单克隆抗体获得。
[0016]进一步地，所述单克隆抗体为生物标志物抗体。
[0017]进一步地，所述生物标志物抗体为癌胚抗原单克隆抗体或甲胎蛋白单克隆抗体。有益效果:与现有技术相比，本发明具有如下优点:
(I)本发明与以前发明的空心金属纳米球相比，基于本发明的单分散性空心金属纳米球制备而成的SERS探针具有非常良好的均一性、灵敏度和可重复性的免疫分析特性。
[0018](2)与现有的空心金属纳米球相比，本发明的空心金属纳米球制备中，作为内核的无机或有机纳米球是商业化产品，各种粒径都有，也就是说空心金属纳米球的空心内核可调；在金属纳米壳的制备中也可以控制金属层的厚度。这样制备的空心金属纳米球的等离激元共振峰可调范围大，有利于获取更大的SERS信号。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1(A)单分散性的空心铜纳米球的消光光谱及扫描电镜图片；(B)单分散性的空心铜纳米球的粒径统计直方图；
图2 (A)加入离子前后金纳米壳的消光光谱(加入离子后金纳米壳的特征消光峰消失，说明金纳米壳发生聚集)；(B)加入离子前后巯基乙醇修饰的空心金纳米球的消光光谱(力口入离子后空心金纳米球的特征消光峰仍然存在，说明没有发生聚集)；
图3 4-巯基苯甲酸修饰的空心金纳米球及单克隆抗体偶联的空心金纳米球的红外图谱(表明4-巯基苯甲酸及单克隆抗体成功修饰到空心金纳米球上)；
图4 (A)钼纳米壳的扫描电镜图及不意图；(B)空心钼纳米球的扫描电镜图及不意图；(C)钼纳米壳和空心钼纳米球的消光光谱；(D)钼纳米壳和空心钼纳米球的SERS光谱图(表明空心钼纳米球的增强效果比钼纳米壳的好)；
图5 (A) CEA单克隆抗体修饰的单分散性空心银纳米球SERS探针对CEA的检测的SERS光谱图；(B)AFP单克隆抗体修饰的单分散性空心铜纳米球SERS探针对AFP的检测的SERS光谱图。
【具体实施方式】
[0020]实施例1:
一种单分散性空心金属纳米球，单分散性空心金属纳米球具有单分散性的空心内核和单分散性的金属纳米外层，所述金属纳米外层为金纳米层，单分散性的空心内核是将二氧化钛纳米球通过腐蚀而成。单分散性空心内核直径为40纳米。金纳米层厚度为20纳米。
[0021]一种单分散性空心金属纳米球的制备方法，包括以下步骤:
Dlml新鲜配置I M的氢氧化钠加入500 ml水中，搅拌，紧接着加入50 μ I四羟甲基氯化磷，磁力搅拌2分钟后5 ml 1%氯金酸加入混合液中,磁力搅拌10分钟即得2 nm的金纳米颗粒，4°C避光保存；
2)将单分散的二氧化钛纳米球乙醇悬浮液与100 μ I的3-氨丙基三乙氧基硅烷通过60°C搅拌4 h来氨基化，乙醇洗涤去除游离3-氨丙基三乙氧基硅烷即得氨基化纳米球。
[0022]3)将经步骤2)处理的氨基化纳米球加入步骤I)处理的金纳米颗粒，磁力搅拌10分钟后离心去除没有吸附的金纳米粒子即得金属纳米壳前体；
4)将经步骤3)处理的金属纳米壳前体加到金的盐溶液中，在加入甲醛作为还原剂磁力搅拌10分钟后，离心收集沉淀即得金属纳米壳；
5)将经步骤4)处理的金纳米壳加到氢氟酸中去除内核即得单分散性空心金纳米球。
[0023]实施例2
一种单分散性空心金属纳米球，单分散性空心金属纳米球具有单分散性的空心内核和单分散性的金属纳米外层，所述金属纳米外层为银纳米层，所述单分散性的空心内核是将单分散的聚苯乙烯纳米球通过腐蚀而成。单分散性空心内核直径为800纳米。银纳米层厚度为500纳米。
[0024]一种单分散性空心金属纳米球的制备方法，包括以下步骤:
1)25 ml新鲜配置I M的氢氧化钠加入1000 ml水中，搅拌，紧接着加入1000 μ I四羟甲基氯化磷，磁力搅拌20分钟后100 ml 1%氯金酸加入混合液中，磁力搅拌50分钟即得3 nm的金纳米颗粒，4°C避光保存；
2)将单分散的聚苯乙烯纳米球的乙醇悬浮液与5000μ I的3-氨丙基三乙氧基硅烷通过80°C搅拌I小时来氨基化，乙醇洗涤去除游离3-氨丙基三乙氧基硅烷即得氨基化纳米球。
[0025]3)将经步骤2)处理的氨基化纳米球加入步骤I)处理的金纳米颗粒，磁力搅拌50分钟后离心去除没有吸附的金纳米粒子即得金属纳米壳前体；
4)将经步骤3)处理的金属纳米壳前体加到银的盐溶液中，在加入过氧化氢作为还原剂磁力搅拌50分钟后，离心收集沉淀即得银纳米壳；
5)将经步骤4)处理的银纳米壳加到甲苯中去除内核即得单分散性空心银纳米球。
[0026]实施例3
一种单分散性空心金属纳米球，单分散性空心金属纳米球具有单分散性的空心内核和单分散性的金属纳米外层，所述金属纳米外层为铜纳米层，所述单分散性的空心内核是将单分散的二氧化硅纳米球通过腐蚀而成。单分散性空心内核直径为400纳米。铜纳米层厚度为250纳米。
[0027]一种单分散性空心金属纳米球的制备方法，包括以下步骤:
1)12 ml新鲜配置I M的氢氧化钠加入720 ml水中，搅拌，紧接着加入500 μ I四羟甲基氯化磷，磁力搅拌10分钟后50 ml 1%氯金酸加入混合液中，磁力搅拌30分钟即得2nm的金纳米颗粒，4°C避光保存；
2)将单分散的二氧化硅纳米球的乙醇悬浮液与2500μ I的3-氨丙基三乙氧基硅烷通过70°C搅拌3小时来氨基化，乙醇洗涤去除游离3-氨丙基三乙氧基硅烷即得氨基化纳米球。
[0028]3)将经步骤2)处理的氨基化纳米球加入步骤I)处理的金纳米颗粒，磁力搅拌30分钟后离心去除没有吸附的金纳米粒子即得金属纳米壳前体；
4)将经步骤3)处理的金属纳米壳前体加到铜的盐溶液中，在加入盐酸羟铵作为还原剂磁力搅拌30分钟后，离心收集沉淀即得铜纳米壳；
5)将经步骤4)处理的铜纳米壳加到氢氟酸中去除内核即得单分散性空心铜纳米球(见图1)。
[0029]实施例4
与实施例1 一样，所不同的在于，步骤2)中3-氨丙基三乙氧基硅烷量为400 μ 1，步骤4)加入的是钼的盐溶液，得到的是单分散性空心钼纳米球，所述单分散的空心内核是由单分散的聚四氟乙烯纳米球通过腐蚀而成。图4表明空心钼纳米球的增强效果比钼纳米壳好。
[0030]实施例5 SERS探针一癌胚抗原(CEA)单克隆抗体修饰的单分散性空心金属纳米球制备
我们选用4-巯基苯甲酸作为拉曼信号分子，同时也是连接CEA单克隆抗体的偶联剂。大概10 μ I新配置的4-巯基苯甲酸(10_3 Μ)加入到7 ml的单分散性空心金属纳米球,搅拌30分钟后，拉曼信号分子通过巯基和Au的作用吸附在空心金球表面。我们用2 μ I的巯基乙醇(2.5 mM，新配制)来覆盖其他非特异性位点，这样可以防止这些位点和其他蛋白作用，同时这样做提高了空心金纳米球的稳定性(如图2所示)；离心去除多余的巯基乙醇，用PBS缓冲液洗三次后用PBS重悬浮，最后5 μ I的水溶性碳化二亚胺(EDC)和氮羟基琥珀酰胺(NHS)加入溶液来活化4-巯基苯甲酸末端的羧基，30分钟后，50 μ ICEA单克隆抗体(40 μ g/ml)加入NHS-活化的空心金球，反应2小时。癌胚抗原(CEA)单克隆抗体通过活化的羧基固定在空心金属纳米球的表面。
[0031]实施例6 CEA单克隆抗体修饰的单分散性空心银纳米球SERS探针的表征
CEA单克隆抗体修饰的单分散性空心金属纳米球进行红外表征，图3给出4-巯基苯甲酸修饰的单分散性空心银纳米球红外光谱(红色)和单克隆抗体修饰的单分散性空心银纳米球红外光谱(黑色)。光谱中在3729 CnT1和675 cnT1处出现在两个谱线是羟基的弯曲振动，表明巯基乙醇已成功修饰到单分散性空心金属纳米球上。在1600 cnT1处的峰值同时出现在两个谱线对应于4-巯基苯甲酸的苯环骨架振动，但1126 cm—1和1374 cm—1的谱线是伯胺的C-N和酰胺C-N的共振峰，说明单克隆抗体已偶联到单分散性空心银纳米球上的4-巯基苯甲酸上。
[0032]实施例7癌胚抗原(CEA)单克隆抗体修饰的单分散性空心银纳米球SERS探针对CEA的检测应用
第一，10 μ?的0.5毫克/毫升的抗体偶联的磁性微球在含CEA抗原10 μ?待测溶液中搅拌20分钟；第二，磁性分离捕获CEA的磁性微球，用PBS缓冲液洗涤三次；第三，得到的磁性微球进一步与10 KLCEA单克隆抗体修饰的单分散性空心银纳米球SERS探针(OD7tltol=
I)下搅拌20分钟。最后，在磁性分离并洗涤三次后分散在10 μ? PBS缓冲溶液形成的夹心免疫复合物悬浮液。没有CEA的作为空白对照组，BSA作为阴性对照组，见图5 (Α)，获得的SERS信号与待测样中的CEA浓度呈线性关系。
[0033]实施例8 SERS探针一甲胎蛋白(AFP)单克隆抗体修饰的单分散性空心钼纳米球制备
我们选用4-巯基苯甲酸作为拉曼信号分子，同时也是连接AFP单克隆抗体的偶联剂。大概10 μ I新配置的4-巯基苯甲酸(10_3 Μ)加入到7 ml的空心钼纳米球，搅拌30分钟后，拉曼信号分子通过巯基和Au的作用吸附在空心钼纳米球表面。我们用2 μ I的巯基乙醇(2.5 mM，新配置)来覆盖其他非特异性位点，这样可以防止这些位点和其他蛋白作用，同时这样做提高了空心钼纳米球的稳定性；离心去除多余的巯基乙醇，用PBS缓冲液洗三次后用PBS重悬浮，最后5 μ I的水溶性碳化二亚胺(EDC)和氮羟基琥珀酰胺(NHS)加入溶液来活化4-巯基苯甲酸末端的羧基，30分钟后，50 μ I AFP单克隆抗体(40 μ g/ml)加入NHS-活化的空心钼纳米球，反应2小时。甲胎蛋白(AFP)单克隆抗体通过活化的羧基固定在空心钼纳米球的表面。
[0034]实施例9甲胎蛋白(AFP)单克隆抗体修饰的单分散性空心钼纳米球检测应用第一，10 μ?的0.5毫克/毫升的抗体偶联的磁性微球在含AFP抗原10 μ?待测溶液中搅拌20分钟；第二，磁性分离捕获AFP的磁性微球，用PBS缓冲液洗涤三次；第三，得到的磁性微球进一步与10 KLAFP单克隆抗体修饰的单分散性空心钼纳米球SERS探针(OD7tltol=
I)下搅拌20分钟。最后，在磁性分离并洗涤三次后分散在10 μ? PBS缓冲溶液形成的夹心免疫复合物悬浮液。没有AFP的作为空白对照组，BSA作为阴性对照组，见图5 (B),获得的SERS信号与待测样中的AFP浓度呈线性关系。
[0035]下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
【权利要求】
1.一种单分散性空心金属纳米球，其特征在于，所述单分散性空心金属纳米球具有单分散性的空心内核和单分散性的金属纳米外层，所述金属纳米外层为金纳米层、银纳米层、铜纳米层或钼纳米层中的一种或几种，所述单分散性的空心内核是通过腐蚀单分散的有机或无机纳米球而成。
2.根据权利要求1所述的一种单分散性空心金属纳米球，其特征在于，所述单分散性空心内核直径为40-800纳米。
3.根据权利要求1所述的一种单分散性空心金属纳米球，其特征在于，所述金属纳米外层厚度为20-500纳米。
4.权利要求1所述的一种单分散性空心金属纳米球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)I?25ml新鲜配置IM的氢氧化钠加入500?1000 ml水中，搅拌，紧接着加入50-1000μ I四羟甲基氯化磷，磁力搅拌2-20分钟后得到混合液，5-100 ml 1%氯金酸加入混合液中，磁力搅拌1(Γ50分钟即得2?3 nm的金纳米颗粒，4°C避光保存； 2)将单分散的有机或无机纳米球的乙醇悬浮液与10(Γ5000μ I的3-氨丙基三乙氧基硅烷通过6(T80°C搅拌f 4小时来氨基化，乙醇洗涤去除游离3-氨丙基三乙氧基硅烷即得氨基化纳米球； 3)将经步骤2)处理的氨基化纳米球加入步骤I)处理的金纳米颗粒，磁力搅拌1(Γ50分钟后离心去除没有吸附的金纳米颗粒即得金属纳米壳前体； 4)将经步骤3)处理的金属纳米壳前体加到金、银、铜或钼的盐溶液中，在加入还原剂磁力搅拌1(Γ50分钟后，离心收集沉淀即得金属纳米壳； 5)将经步骤4)处理的金属纳米壳加到氢氟酸或甲苯中去除内核即得单分散性空心金属纳米球。
5.根据权利要求4所述的一种单分散性空心金属纳米球的制备方法，其特征在于，所述有机或无机纳米球为二氧化娃纳米球、二氧化钛纳米球、聚苯乙烯纳米球，聚四氟乙烯纳米球。
6.根据权利要求4所述的一种单分散性空心金属纳米球的制备方法，其特征在于，所述步骤4)中的还原剂为甲醛、过氧化氢或盐酸羟铵。
7.权利要求1所述的一种单分散性空心金属纳米球在制备SERS探针中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述SERS探针是通过吸附在单分散性空心金属纳米球表面的拉曼信号分子并偶联单克隆抗体获得。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述单克隆抗体为生物标志物抗体。
10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述生物标志物抗体为癌胚抗原单克隆抗体或甲胎蛋白单克隆抗体。
【文档编号】G01N33/577GK104360064SQ201410577586
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年10月24日 优先权日:2014年10月24日
【发明者】董健, 郭明德, 谢溦, 钱卫平 申请人:东南大学