番茄酱中多种农药残留量的快速检测方法及其前处理方法与流程

本发明涉及一种用于对番茄酱中多种农药残留量进行快速检测的前处理方法，还涉及使用该前处理方法，采用气相色谱-火焰光度检测器、气相色谱-电子捕获检测器和液相色谱-串联四级杆质谱器分析番茄酱中多种农药残留量的快速检测方法，属于食品安全检测领域。

背景技术：

番茄种植过程中会使用多种农药，这些农药性质稳定，不易降解，在番茄加工过程中会残留在最终产品——番茄酱里，形成农药残留风险。目前国内使用的农药可达几百种，在番茄种植过程中也可能用到上百种农药，如何对番茄酱中的多种农药进行跨种类的快速检测是农药残留检测的难点。目前，番茄酱中多农药残留的检测方法主要包括气相色谱法、液相色谱法、气相色谱-质谱法和液相色谱-质谱法等。气相色谱法可检测有机氯和拟除虫菊酯类、有机磷农药，液相色谱法可检测氨基甲酸酯类农药，它们都属于较低成本的检测方法。气相色谱-质谱法与液相色谱-质谱法可检测的农药范围和种类较多，利用多反应监测模式(Multiple Reaction Monitoring，MRM)可在复杂基质中对目标农药实现高选择性检测。这些检测方法都需要对农产品进行一定的前处理，以得到适合于进行色谱分析的样品。

目前，番茄酱中农药残留检测的前处理方法较多，主要包括液液提取、基质固相萃取和分散固相萃取等。其中液液萃取净化效果较差，存在较大的基质干扰和基质效应；基质固相萃取处理需要对样品进行手工研磨，操作相对复杂，无法实现高通量操作；而基于分散固相萃取的QuEChERS方法则利用一定的吸附填料进行简单净化，操作简单且快速，杂质干扰较少。

另一方面，现有的农药残留检测方法大多需要根据农药类别进行针对性的样品前处理，例如，我国国家标准GB/T 5009.218-2008(水果和蔬菜种多种农药残留量的测定)中记载了使用丙酮、甲醇、二氯甲烷、苯、正己烷、乙醇等多种溶剂对样品进行提取。而现有农药种类则有数 千种，不同种类的农药也需要相应的前处理方法。分别进行针对性的样品前处理将耗费大量时间和人力物力。因此，如何实现番茄酱中农药残留量的快速检测是农药残留分析检测领域的重要课题。从而，目前对于采用统一的前处理方法，随后按照农药的物理化学性质采用不同的仪器检测方法来实现多种农药残留的快速检测存在着实际需求。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有的农药残留检测方法检测种类少，处理时间长等缺点，开发一种低成本、高覆盖率和高效的番茄酱中多种农药残留量进行检测的方法；同时，本发明通过采用统一的样品前处理方法对番茄酱样品进行提取、净化和浓缩，并在之后采用不同的仪器检测方法，实现对番茄酱中多种农药残留简单方便地实行快速检测。本发明所述的用于对番茄酱中多种农药残留量进行快速检测的前处理方法主要由以下步骤组成：

(1)向待测番茄酱中加入蒸馏水和任选地包含1％乙酸的乙腈，再加入氯化钠盐析，使用超声辅助进行提取后以无水硫酸镁干燥，随后高速离心，然后移出上清液；

(2)向该上清液中加入石墨化炭黑(GCB)和N-丙基乙二胺键合的硅胶吸附剂(PSA)以及无水硫酸镁，涡旋振摇后离心，获得上清净化液；

(3)将步骤(2)中获得的所述上清净化液分成三份，第一份用氮气浓缩至干，再用正己烷复溶，然后进行膜过滤，得到用于GC-ECD分析的待测液体样品；第二份用氮气浓缩近干，再用乙腈复溶，进行膜过滤，得到用于GC-FPD分析的待测液体样品；第三份直接进行膜过滤，得到用于LC-MS/MS分析的待测液体样品。

在本发明的样品前处理方法的优选的实施方式中，步骤(1)满足如下条件中的一项或多项：所述待测番茄酱的取用量为5-10g，蒸馏水的加入量为5-10g，氯化钠的加入量为1-10g，乙腈的加入量为5-40mL，无水硫酸镁的加入量为5-10g；超声辅助提取时间为30min；和/或所述高速离心以5000r/min进行5min。

在本发明的样品前处理方法的一个实施方式中，步骤(2)满足如下 条件中的一项或多项：所述石墨化炭黑的平均粒径为120-400mesh；所述N-丙基乙二胺键合的硅胶吸附剂的平均粒径为40-60mesh；和/或所述GCB和PSA的使用量范围分别是50-250mg和100-300mg、优选分别是50mg和250mg，并且无水硫酸镁的使用量为0.5-2g、优选1g。

在另一方面，本发明提供了一种对番茄酱中多种农药残留量进行快速检测的方法，所述方法包括：

(a)用本发明所述的前处理方法进行处理待测番茄酱，得到三份待测液体样品；

(b)分别使用GC-ECD、GC-FPD和LC-MS/MS对步骤(a)中得到的三份待测液体样品进行分析。

本发明所述的方法与现有技术相比有以下优点：

由于本发明采用乙腈提取番茄酱中的农药残留，通过加入一定量的氯化钠，因此可以对常见农药(包括有机磷类农药、有机氯类农药、拟除虫菊酯类农药、氨基甲酸酯类农药和其它常见农药)进行充分的提取，去除了番茄酱基质中的干扰物，还可以减少对仪器进样口和色谱柱的损伤。

另一方面，本发明采用分散固相萃取的方式净化样品提取溶液，通过加入一定量的GCB和N-丙基乙二胺(PSA)键合的硅胶，不但可以有效去除基质中的色素和糖类物质等干扰物，并且净化剂的混合使用可以获得更好的加标回收率。

另外，本发明将多种类农药的前处理方法进行了统一，即采用同一种样品前处理方法处理了多种农药，节省了农药残留检测过程中最复杂、最耗时和最消耗溶剂的步骤，大大简化了以往针对多种农药残留检测采用多种样品前处理时所消耗时间，显著降低了检测成本，利用不同的检测技术实现了多种农药残留检测，非常适合于番茄酱中的农药检测。

附图说明

图1是本发明所采用的番茄酱多农药残留检测技术示意图。

图2是32种有机磷农药的加标回收实验色谱图。

在图2中，各个色谱峰依据图中标号分别为：1-甲胺磷；2-敌敌畏； 3-乙酰甲胺磷；4-氧乐果；5-内吸磷；6-灭线磷；7-治螟磷；8-久效磷；9-甲拌磷；10-乐果；11-特丁硫磷；12-地虫硫磷；13-氯唑磷；14-磷胺；15-甲基毒死蜱；16-甲基对硫磷；17-杀螟硫磷；18-马拉硫磷；19-毒死蜱；20-倍硫磷；21-对硫磷；22-水胺硫磷；23-甲基异柳磷；24-硫环磷；25-杀扑磷；26-苯线磷；27-丙溴磷；28-乙硫磷；29-三唑磷；30-亚胺硫磷；31-伏杀硫磷；32-蝇毒磷。

图3是34种有机氯和拟除虫菊酯农药的加标回收实验色谱图。

在图3中，各个色谱峰依据图中标号分别为：1-六氯苯；2-α-六六六；3-五氯硝基苯；4-γ-六六六；5-β-六六六；6-七氯；7-δ-六六六；8-百菌清；9-艾氏剂；10-三氯杀螨醇；11-环氧七氯B；12-环氧七氯A；13-腐霉利；14-o,p’-滴滴伊；15-α-硫丹；16-p,p’-滴滴伊；17-狄氏剂；18-o,p’-滴滴滴；19-o,p’-滴滴涕；20-p,p’-滴滴滴；21-β-硫丹；22-p,p’-滴滴涕；23-联苯菊酯；24-硫丹硫酸酯；25-甲氰菊酯；26-高效氯氟氰菊酯；27-灭蚁灵；28/29-氯菊酯；30-哒螨灵；31/35/36-氟胺氰菊酯；32/33/34-氯氰菊酯；37/38-高效氰戊菊酯；39/40-溴氰菊酯；41-苯醚甲环唑。

图4A-4C图是19种其它常见农药的液相色谱-串联四级杆质谱MRM获得的加标回收实验色谱图。

图5示出了有机磷类农药加标回收率实验的实验结果。

图6示出了有机磷类农药重复性实验的实验结果。

图7示出了有机氯和拟除虫菊酯类农药加标回收率实验的实验结果。

图8示出了有机氯和拟除虫菊酯类农药重复性实验的实验结果。

具体实施方式

如图1所示，本发明采用统一样品前处理方法，对番茄酱样品进行提取、净化和浓缩之后，再通过不同的仪器检测方法，实现对番茄酱中多种农药残留的快速检测。

在本发明前处理方法中，步骤(1)中加入的乙腈任选地包含1％的乙酸，乙酸的加入可进一步对样品中的碱不稳定性农药进行稳定，从而提高检测准确率。

在步骤(3)中，获取用于GC-FPD分析的待测液体样品时，对样品进行氮吹近干。所述“近干”是指不必将样品完全吹干，而是在样品中基本无可见液态溶剂存在时即停止氮吹，稍放置后即可进一步加入乙腈复溶。具体而言，“近干”可以是指样品中的乙腈溶剂含量在5wt％以下。

本发明所有具体实施例中所使用的GCB和PSA，是指石墨化炭黑和N-丙基乙二胺键合的硅胶吸附填料，其具体信息如下：

产品名称：GCB，平均粒径：120-400mesh；产品名称：PSA，平均粒径：40-60mesh，(均购自天津博纳艾杰尔公司)。

本发明各个实施例中所采用的具体样品前处理过程如下：

(1)制样：称取约500g番茄酱，充分搅拌之后备用；

(2)提取：称取5g样品(准确至0.01g)的50mL塑料离心管中，加入5mL超纯水，使水和番茄酱充分混匀；再准确加入20mL含1％乙酸的乙腈和3g氯化钠，用涡旋振荡器振荡2min；之后放入超声波发生器，超声辅助提取30min，其中超声波发生器内装有冰袋，防止在超声提取过程中温度上升；加入5g无水硫酸镁，剧烈振摇，让无水硫酸镁尽量吸附样品中的水分；再以5000r/min离心5min，获得离心后的上清提取溶液。

(3)净化：提前称取混合净化剂1.3g(由50mg GCB、250mg PSA和1g无水硫酸镁组成)于50mL离心管中，加入上层提取液15mL；将离心管在涡旋振荡器上振荡3min，保证提取液和净化剂充分混合；之后以5000r/min离心5min。

(4)浓缩与复溶：将步骤(3)中获得的上清净化液分成三份，分别进行下列处理：

取4mL上清净化液用氮气浓缩至干，再用正己烷复溶，然后进行膜过滤，得到用于GC-ECD分析的待测液体样品；

取4mL上清净化液，用氮气浓缩近干，再用乙腈复溶，进行膜过滤，得到用于GC-FPD分析的待测液体样品；

取适量体积的上清净化液，进行膜过滤，得到用于LC-MS/MS分析的待测液体样品。

在另一方面，本发明还涉及分别通过不同检测手段，使用上述前处 理方法获得的待测液体样品进行快速检测。

本发明所采用的检测技术为用气相色谱-火焰光度检测器(GC-FPD)、气相色谱-电子捕获检测器(GC-ECD)和液相色谱-串联四级杆质谱法(LC-MS/MS)作为仪器检测方法。所采用的检测仪器具体型号为，并使用以下操作参数：

(1)有机氯、拟除虫菊酯农药(GC-ECD检测)：色谱柱：DB-35ms(30m×0.25mm×0.25μm)；程序升温：100℃保持2min，然后以10℃/min升温至300℃，保持18min；载气：高纯氮气，恒流模式，流速为1.0mL/min；进样口温度：220℃；进样方式：分流进样，分流比：10:1；进样量：1μL；检测器温度320℃。

(2)有机磷农药(GC-FPD检测)：色谱柱：DB-5ms(30m×0.25mm×0.25μm)；程序升温：80℃保持1min，然后以10℃/min升温至280℃，保持5min，以20℃/min升温至300℃，保持18min；载气：高纯氮气，恒流模式，流速为1.0mL/min；进样口温度：220℃；进样方式：不分流进样；进样量：1μL；检测器温度250℃；H2流量：75mL/min，空气流量：100mL/min。

(3)其它常见农药(LC-MS/MS检测)：超高效液相色谱条件色谱柱Waters ACQUITY UPLC CSH C18柱(2.1mm×100mm.i d.，1.7μm)；柱温40℃；样品温度20℃；进样体积2μL。流动相A为含0.1％(体积分数)甲酸-水溶液，流动相B为含0.1％(体积分数)甲酸-乙腈，梯度洗脱程序见表1。流速为0.2mL/min。

表1：UPLC流动相梯度条件

质谱条件：采用电喷雾离子源，ESI正模式；毛细管电压：3.0kV；电喷雾电离((ESI)源温度：150℃；脱溶剂温度：500℃；脱溶剂气流量((氮气)：1000L/h；锥孔气流：150L/h；碰撞气氩气：0.15mL/min；光电倍增器电压：535V；扫描方式：多反应监测模式(MRM)。

表2：19种其它常见农药在MRM模式下UPLC-MS/MS分析的质谱参数

在番茄酱中添加不同种类的农药，经本发明提出的样品前处理和检测技术路线，结合GC-ECD、GC-FPD和LC-MS/MS检测获得加标回收实验的色谱图，如图2-4所示。

本发明提供的技术路线对多种类农药的加标回收率、重复性实验均满足GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范食品理化检测》中规定的农药残留检测要求，参见图5-图8和以下表3-表5的记载。

表3：32种有机磷类农药的平均加标回收率和相对标准偏差

表4：34种有机氯和拟除虫菊酯类农药的平均加标回收率和相对标准偏差

表5：19种其它常见农药的平均加标回收率和相对标准偏差

由以上表格中的数据以及附图中的数据可见，本发明的快速检测方法通过使用同一种前处理方法并随后使用不同检测方法进行检测，实现了快速准确的多种农药残留量检测，获得了优异的结果。

本发明的方法与现有技术的比较

本发明提供的样品前处理方法步骤包括超声提取，盐析，离心，净化和浓缩，单个样品消耗时间约为1小时；而根据行业标准NYT 761-2008文本提供的内容，该标准需要对有机氯和拟除虫菊酯类农药检测项目进行样品的SPE净化，消耗时间约为单个样品2小时，同时有机磷类农药检测项目没有净化，而是直接进入气相色谱检测，对仪器和色谱造成一定的损伤。具体的对比参见以下表6的记载。

表6：本发明与NYT 761-2008的对比

以上结合附图详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。